重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺

摘要

一种重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，所述的构建方法包括：以嗜热菌中编码SOD的基因为模板，设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增目的基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建重组质粒，命名为pSOD，然后经化学转化法将质粒pSOD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选，获得高产SOD的菌株，完成SOD工程菌的构建；所述的发酵工艺：发酵过程经过一级种子培养、二级种子培养、上罐发酵、诱导表达四个步骤，最终获得发酵产物-SOD；本发酵方法可以实现SOD的高效表达，目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的60％以上；它具有SOD有良好热稳定性与耐热性，表达产物占全菌蛋白的60％以上，且全部为可溶性蛋白，避免了包含体复性过程的种种麻烦；纯化工艺简单，产率高，成本低廉，终产物SOD的纯度高、活力高、稳定性强等特点。

主权项

一种重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺，其中所述的超氧化物岐化酶为嗜热菌的超氧化物岐化酶，所述的发酵工艺至少包括：经过一级种子培养、二级种子培养、上罐发酵、诱导表达四个步骤，最终获得发酵产物‑SOD，且该发酵工艺可以实现SOD的高效表达，使目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的60％以上；所述的纯化工艺包括：(1)收集发酵产物‑SOD，(2)经ATS高压匀浆机将细胞破碎，使胞内酶完全释放出来得到粗酶液；(3)然后将粗酶液经80℃水浴2小时，(4)待冷却至室温后12000g，4℃，离心30min；(5)收集上清，调pH＝6.92；(6)缓缓加入4℃预冷的95％的乙醇，并不断搅拌V乙醇∶V酶上清＝2∶1；(7)4℃静置30min后，12000g，4℃，离心30min；(8)弃上清，沉淀在40℃烘箱中烘干多余的乙醇；(9)用Buffer A重溶解乙醇沉淀后透析过夜，所述Buffer A为10mMTris‑HCl，pH8.0；(10)透析之后的产物分装干燥、制成SOD纯品；所述的发酵工艺，其发酵基本培养基按照如下高密度发酵基本培养基进行配制；  营养  终浓度  胰蛋白胨  10g/L  酵母提取物  10g/L  NaCl  10g/L  葡萄糖  20g/L  K2HPO4  2g/L  MgSO4·7H2O  0.25g/L  (NH4)2SO4  5g/L  Kana  50mg/L发酵用补料培养基按照如下高密度发酵补料培养基进行配制，补料间隔为4‑5h； 成份  补料量  补料频率 葡萄糖  80g  5h (NH4)2SO4  20g  5h K2HPO4  8g  5h所述的发酵工艺，其发酵条件为溶氧30％、温度30℃、pH7.0、转速在200rpm到800rpm之间根据溶氧自动调节；所述的发酵进行5‑6小时，OD600为25‑28时加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM。