基于荧光共振能量转移的甲基化DNA检测方法

摘要

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续的序列，设计并合成正向引物，标记有报告荧光团和淬灭荧光团的反向引物；步骤3，进行PCR扩增反应；步骤4，检测特定报告荧光团发射波长的荧光信号，并判定待测DNA样品中是否存在甲基化DNA。本发明具有灵敏度高、特异性好、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

主权项

一种基于荧光共振能量转移的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA样品、标准甲基化DNA样品和标准非甲基化DNA样品；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续的序列，使所选的这一段序列中至少有一个CpG位点，且在这一段序列的中部或靠近3’端的位置，而不出现除CpG位点以外的C；以所选连续序列或所选序列5’端的一部分作为PCR正向引物；以所选连续序列的下游区域且紧邻所选连续序列的一段序列的互补序列作为反向PCR引物，并使所述反向引物的3’端的最后一个碱基正好位于对应的CpG位点的C的位置；将所述反向引物3’端最后一个碱基用A替代，作为A引物；同时，将所述反向引物3’端最后一个碱基用G替代，作为G引物；并在反向引物A或G上标记有淬灭荧光团，在靠近3’端的一个碱基上标记报告荧光团；步骤3，加入具有3’～5’ 外切酶活性的DNA聚合酶，用上述引物在实时定量PCR仪中，对处理过的待测DNA样品进行PCR扩增反应；并用标准的非甲基化DNA和甲基化DNA作为对照；步骤4，检测PCR扩增信号，并与标准甲基化DNA样品的PCR扩增信号对照，如果待测样品中出现反向引物A的PCR扩增信号，且甲基化DNA标准品也出现反向引物A的PCR扩增信号，而非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中存在甲基化DNA；如果待测样品中仅出现反向引物G的PCR扩增的信号而不出现反向引物A的PCR扩增的信号，且甲基化DNA标准品出现反向引物A的PCR扩增信号，同时非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中不存在甲基化DNA。