一种茭白总蛋白质的提取纯化方法

摘要

本发明提供了一种茭白与菰黑粉菌互作过程中茭白蛋白质的提取方法，所述方法是模拟茭白植株与菰黑粉菌二者之间的互作，提取到不相互混杂的茭白植物基因组和蛋白。利用本发明方法，制得茭白总蛋白产品不混杂有菰黑粉菌的蛋白质，且蛋白含量高，杂质少，核酸含量低，能满足双向电泳对蛋白质纯度的要求。

主权项

一种茭白总蛋白质的提取纯化方法，所述方法包括：(1)菰黑粉菌的分离及培养：将菰黑粉菌冬孢子在PSA平板上培养3～5d，挑取特征菌落再次接种到PSA平板上纯化培养15～20d后，用4～5mm打孔器于生长活跃的菌落边缘打孔，将圆形菌块接种到PSA平板上，培养条件为：24～28℃，相对湿度75～85％；(2)茭白组织培养：以茭白中雄茭茎部的互生侧芽为培养材料，接种在愈伤诱导培养基上，培养室温度控制在25±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为15～18h/d；(3)互作培养：选取步骤(2)得到的生长良好的茭白愈伤组织，转移到中间挖孔的水琼脂培养基上；将步骤(1)中分离培养的1～1.5cm2菰黑粉菌菌落接种到覆盖有赛璐玢膜的PSA培养基上培养3～4天后，将赛璐玢膜及菰黑粉菌菌落一起移到培养着茭白愈伤组织的水琼脂培养基上；(4)取互作培养10～20天的茭白愈伤组织碎片、液氮研磨，得粉末；(5)取步骤(4)所得粉末，用蛋白提取液1于‑20～‑10℃悬浮沉淀0.5～2小时，离心，弃上清液，得沉淀1；所述蛋白提取液1为含有10％三氯乙酸和0.07％β‑巯基乙醇的丙酮溶液；(6)取步骤(5)所得沉淀1，用蛋白提取液2于‑20～10℃悬浮清洗0.5～2小时，离心，弃去上清液，取沉淀重复上述悬浮清洗和离心步骤1～4次，得沉淀2；所述蛋白提取液2为含0.07％β‑巯基乙醇的丙酮溶液；(7)将步骤(6)所得沉淀2干燥，用蛋白裂解液室温下裂解0.5～2小时；裂解产物离心，取上清液，即为含有所述茭白总蛋白质的溶液；所述蛋白裂解液组成如下：尿素6.8～7.2mol/L，硫脲1.9～2.1mol/L，CHAPS 3.5～4.3％，花萼海绵诱癌素4.8～5.2％，DTT0.7～1.2％，PMSF 0.8～1.1mmol/L，溶剂为水。