猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列，针对PA序列相对保守区域设计了SIV RT-LAMP简并引物6条，以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板，建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT-LAMP方法。利用LA-320 LAMP Tubidimeter仪分析反应过程并判定结果，显示在LA-320 LAMP Tubidimeter仪中63℃反应45min，所有实验用的4种亚型SIV样品RNA均获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明：本方法可对100TCID50 SIV样品RNA进行10-4稀释后仍可高效扩增，显示出本方法高度的敏感性；通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT-LAMP检测，有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT-PCR、鸡胚分离结果一致，经基因芯片分型鉴定验证，综合结果符合率为100％。显示本方法特异、敏感、快速，适合用于各种试验条件下SIV的检测。

主权项

一种检测猪流感病毒的RT‑LAMP检测试剂盒，其特征是该试剂盒包含以下组分：(1)提取RNA试剂LBB II‑RNA由以下溶液组成：RA：取1％2‑巯基乙醇0.6ml，pH 8.0 1％Tris‑HCL 0.6ml，10mmol/ml EDTA 1ml，灭菌双蒸水5.0ml；RB：6mmol/ml异硫氰酸胍35ml；RC：无水乙醇15ml；RD：100U/μl DNAse A 20μl、10ml DEPC H2O；(2)反应试剂：50个反应量1)引物混合液PM：所用的引物序列为：F3‑PA：AGGGGTCTATGGGATTCCTTB3‑PA：GAAAGCTTGCCCTCAATGFIP‑PA：WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGCBIP‑PA：RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACALF‑PA：AATCTTTCTTCAATTGTGTCLB‑PA：CCGAACTTCTCCAGCCTTGA取100pmol/μl F3‑PA2.5μl，100pmol/μl B3‑PA2.5μl，100pmol/μl FIP‑PA20.0μl，100pmol/μl BIP‑PA20.0μl，100pmol/μl LF‑PA10.0μl，100pmol/μl LB‑PA10.0μl混合，灭菌去离子水定容至总体系75.0μl，每个反应需取1.5μl PM；2)反应缓冲混合液RM：取4mmol/μl硫酸镁50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μldNTPs 50μl，溶于475μl PCR级水中定容至625μl，每个反应需取12.5μl RM；3)反应酶混合液EM：取16U/μl Bst大片段DNA聚合酶24μl，400U/μl AMV反转录酶24μl，1μmol/μl DTT 2μl，每个反应需要取1μl EM；4)显色剂：取1μl SYB Rgreen I溶于49μl PCR级水，每个反应加1μl。