一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法

摘要

本发明提供一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法，将慢病毒载体与病毒包装质粒共转染为293T细胞，至48小时后离心，得慢病毒的浓缩液，将其注射于成熟24-25小时的卵母细胞卵周隙内，与精子结合实施体外受精，12小时后置于培养液中培养，48小时后统计卵裂率和转基因率。其一取卵母细胞用体外成熟液洗涤3-4次，按25-30枚/滴入体积75-78μl/滴的体外成熟培养液，在5％CO2、95％下培养；其二体外成熟的卵母细胞脱去卵丘细胞，慢病毒注射入细胞卵周隙内，用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴入受精液内；解冻精液，移入受精液，离心弃上清液，沉淀精子加受精液滴，孵育；取受精12-18小时的卵，按上步处理后入四孔培养板内培养即可；其三为药剂慢病毒液、抽卵液、成熟液、显微操作液、SOF、受精液、培养液、养血清的必备。

主权项

一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊受精卵的方法，其特征在于：将慢病毒载体与病毒包装质粒共转染为293T细胞，至48小时后离心，得慢病毒的浓缩液，将其注射于成熟24‑25小时的卵母细胞卵周隙内，与精子结合实施体外受精，12小时后置于培养液中培养，48小时后统计卵裂率和转基因率；其一，取绵羊卵巢，用生理盐水灭菌清洗3‑4次，抽取卵母细胞，用体外成熟液洗涤3‑4次，按25‑30枚/滴入前2小时平衡好的体积为75‑78μl/滴的体外成熟培养液滴，放入CO2箱，在5％CO2，95％空气条件下培养；其二，将体外成熟24‑25小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理30‑60s，经吹吸，脱去卵丘细胞；将慢病毒注射入卵母细胞卵周隙内，用体外受精液洗涤2‑4次，按25‑30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50‑70μl的受精液内；用水浴解冻精液，移入2小时前平衡好的装有受精液的试管内，放入C02箱，上游20‑25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4‑5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2‑4×106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；其三，将受精12‑18小时后的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3‑4次，按50‑70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养；药剂的配制：抽卵液：TCM199‑hepes十1mg/mlPVA十0.7mg/ml肝素钠；成熟液：TCM199‑HCO3十10％FBS十0.05IU/ml FSH十0.05IU/ml LH十1μg/ml雌二醇+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；显微操作液：PBS+10％FBS；SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；受精液：SOF+20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；其采羊的静脉血，放置4℃冰箱内冷冻24小时，将析出的血清放在56℃水浴锅内灭活30‑33分钟，即得发情羊血清；培养液：SOF+3mg/ml BSA。