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一种香草醛‑硫酸比色法测定光甘草定含量的方法，该方法主要涉及到：光甘草定的标准品纯度HPLC≥98%，无水甲醇，质量百分比浓度是98%的硫酸，香草醛，恒温水浴锅，比色皿，紫外可见分光光度计；该方法通过B环具有间苯二酚结构且C环C2、C3是单键的光甘草定与香草醛试剂发生反应并在质量百分比浓度是98%的硫酸酸性条件下使反应液显色，再利用紫外可见分光光度计测定该显色液在其最大吸收波长534nm下的吸光度值，从而完成显色液吸光度值信息的采集过程：在所述酸性条件下，显色液的颜色深浅与光甘草定的含量呈显著线性正相关关系，符合朗伯‑比尔定律，从而为光甘草定标准检测溶液‑平均吸光度值的线性回归方程建立奠定了基础，所述线性回归方程为以后待测光甘草定含量的测定提供了定量标准；其特征是：所述显色液吸光度值信息的采集过程如下：①配制浓度为20 mg/mL 的香草醛甲醇溶液用烧杯称取2.0g的香草醛，向烧杯中加入少量无水甲醇以溶解香草醛，将溶解后的香草醛甲醇溶液转移到100 mL的第一容量瓶中，再用少量无水甲醇润洗烧杯2‑3次，并将润洗后的香草醛甲醇溶液也转移到第一容量瓶中，再向第一容量瓶中加入无水甲醇溶液至100 mL刻度为止，摇匀后得到浓度为20 mg/mL的香草醛甲醇溶液；②配制体积百分比浓度为30%的硫酸甲醇溶液用移液管准确量取30 mL质量百分比浓度是98%的硫酸并置于100 mL的第二容量瓶中，再向第二容量瓶中加入70 mL的无水甲醇，摇匀后得到体积百分比浓度为30%的硫酸甲醇溶液；③配制浓度为0.5 mg/mL的光甘草定标准溶液用烧杯称取12.5 mg光甘草定的标准品，向烧杯中加入少量无水甲醇以溶解光甘草定的标准品，将溶解后光甘草定的标准品甲醇溶液置于25mL的第三容量瓶中，再用少量无水甲醇润洗烧杯2‑3次，并将润洗后光甘草定的标准品甲醇溶液也转移到第三容量瓶中，再向第三容量瓶中加入无水甲醇溶液至25 mL刻度为止，摇匀后得到浓度为0.5 mg/mL的光甘草定标准溶液；④配制一十四份浓度范围在0.01～0.5 mg/mL的光甘草定标准检测溶液分别吸取③中光甘草定标准溶液一十四份，所述一十四份0.5 mg/mL光甘草定标准溶液的吸取量依次为0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL、1.3 mL、1.4 mL、2.0 mL、2.6 mL、3.2 mL、3.8 mL、4.4 mL和5.0 mL，并分别置于一十四个5 mL容量瓶中，再向一十四个5 mL容量瓶中依次加入无水甲醇至5 mL刻度为止，摇匀后得到一十四份浓度依次为0.01 mg/mL、0.03 mg/mL、0.05 mg/mL、0.07 mg/mL、0.09 mg/mL、0.11 mg/mL、0.13 mg/mL、0.14 mg/mL、0.2 mg/mL、0.26 mg/mL、0.32 mg/mL、0.38 mg/mL、0.44 mg/mL和0.5 mg/mL的光甘草定标准检测溶液，或简称为一十四份浓度范围在0.01～0.5 mg/mL的光甘草定标准检测溶液；⑤采集吸光度值从上述④中得到的一十四份浓度范围在0.01～0.5 mg/mL的光甘草定标准检测溶液中各吸取0.5 mL并分别加入到一十四个10 mL的具塞试管中，然后对所述一十四个10 mL的具塞试管分别加入2.5 mL上述①中配制的浓度为20 mg/mL 的香草醛甲醇溶液和2.5 mL 上述②中配制的体积百分比浓度为30%的硫酸甲醇溶液，然后对所述一十四个10 mL的具塞试管进行封盖并摇晃混匀后置于20 ℃水浴中保温20 min后取出，每个具塞试管得到5.5 mL的澄清显色液，共得到一十四份所述显色液；从每个具塞试管中提取小于1∕3的所述显色液并置于比色皿中，利用紫外可见分光光度计采集所述显色液的吸光度值信息，这样在使用同一比色皿情况下得到一十四份所述显色液的一十四个不同数值的吸光度值信息，这一十四个不同数值的吸光度值信息称为一组，在相同条件下共做三组平行试验以获取三组不同数值的吸光度值信息；将三组中相同浓度所述显色液所采集的三个吸光度值进行算术平均，即得到三组相同浓度所述显色液的平均吸光度值，按此方式能够得到三组中其它浓度所述显色溶液的平均吸光度值，共得到一十四个平均吸光度值，所述一十四个平均吸光度值与上述④中得到的一十四份浓度范围在0.01～0.5 mg/mL的光甘草定标准检测溶液相对应；所述光甘草定标准检测溶液‑平均吸光度值的线性回归方程建立过程如下：⑥以上述④中所述一十四份浓度依次为0.01 mg/mL、0.03 mg/mL、0.05 mg/mL、0.07 mg/mL、0.09 mg/mL、0.11 mg/mL、0.13 mg/mL、0.14 mg/mL、0.2 mg/mL、0.26 mg/mL、0.32 mg/mL、0.38 mg/mL、0.44 mg/mL和0.5 mg/mL的光甘草定标准检测溶液为x轴，以上述⑤中所述一十四个平均吸光度值为y轴建立光甘草定标准检测溶液‑平均吸光度值的线性回归方程，通过EXECL软件的计算所述线性回归方程由y=4.4483x和y=1.4208x+0.4013表示，其中y=4.4483x是光甘草定标准检测溶液在其浓度为0.01 mg/mL、0.03 mg/mL、0.05 mg/mL、0.07 mg/mL、0.09 mg/mL、0.11 mg/mL、0.13 mg/mL和0.14 mg/mL时的线性回归方程，线性浓度范围：（0.01‑ 0.14 ）mg/mL，相关系数R²=0.9999；y=1.4208x+0.4013是光甘草定标准检测溶液在其浓度为0.14 mg/mL、0.2 mg/mL、0.26 mg/mL、0.32 mg/mL、0.38 mg/mL、0.44 mg/mL和0.5 mg/mL时的线性回归方程，线性浓度范围：（0.14‑ 0.5） mg/mL，相关系数R²=0.9957；可以看出：x=0.14 mg/mL是y=4.4483x和y=1.4208x+0.4013的分界拐点，在所述分界拐点时两个线性曲线具有不同斜率。 |
