一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系

摘要

本发明涉及一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系，即将经过体外定向分子进化或化学诱变得到的二羟基双加氧酶突变库，涂布于固体培养基上，通过硝酸纤维素膜影印后进行显色初步筛选，再结合96孔板进行活性定量分析。本发明方法能够获得比试管培养更大的筛选能力，能够在短时间内进行二羟基双加氧酶突变库筛选。因而通过本发明方法可以开展二羟基双加氧酶突变和高通量筛选，能够较大幅度的提高二羟基双加氧酶的突变筛选效率。

主权项

一种基于硝酸纤维素膜的二羟基双加氧酶改组突变高通量筛选体系，其特征在于，包括下列步骤：(1)二羟基双加氧酶突变基因的获得：采用两步连续延伸PCR方法合成二羟基双加氧酶基因RRBPHCI，其碱基序列如SEQ ID No 1所示；(2)上述获得的二羟基双加氧酶突变基因，经BamHI和SacI双酶切后，植入含氨苄青霉素抗性基因的载体pYPX251中，获得带庆大霉素抗性基因原核启动子及t1t2终止子的二羟基双加氧酶基因突变基因原核表达载体质粒，再经电击将质粒转入宿主菌大肠杆菌DH5α中，在氨苄青霉素的固体培养基上培养得转化子；(3)将上述长出的二羟基双加氧酶突变基因的大肠杆菌转化子，影印至硝酸纤维素膜上，以二羟基联苯为底物进行高通量筛选。