樱桃S基因型的快速鉴定方法

摘要

本发明一种樱桃S基因型的快速鉴定方法，包括：步骤1樱桃基因组DNA提取。步骤2制备AS-PCR体系及反应，其中，樱桃S基因的特异性引物对为：上游引物5’-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3’，下游引物5’-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3’。步骤3将PCR产物进行凝胶电泳及成像鉴定。本发明旨在提供一种操作简便、速度快、成本低、鉴定范围较广的樱桃S基因型快速鉴定方法，以便为樱桃栽培时合理地配置授粉树，为樱桃自交亲和育种，为樱桃自交亲和新品种育种提供理想的种质资源，为鉴定更多的S基因包括S4’基因等提供一种十分有效的方法。

主权项

一种樱桃S基因型的快速鉴定方法，其特征在于，包括：步骤(S1)樱桃基因组DNA提取技术，具体过程包括：(S1a)取100‑200mg已经去掉主要脉络的樱桃叶片、加1‑2mg石英砂在液氮辅助下研磨成粉末状，移入1.5ml Eppendorf管中，加入600μl缓冲液，混匀；4℃，12000rpm，离心5分钟；(S1b)取上清，加入体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇溶液，混匀，4℃，12000rpm，离心5分钟；(S1c)取上清，加入体积比依次为24∶1的氯仿、异戊醇溶液，混匀，4℃，12000rpm，离心5分钟。重复1‑2次，以蛋白层不出现为止；(S1d)取水相，加2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积3mol/L pH5.3的NaAc，混匀；‑20℃放置0.5小时；4℃，12000rpm，离心5分钟；(Se)弃上清，用70％无水乙醇洗沉淀1次；(S1f)室温下干燥后，溶于30‑50μl TE或DEPC水中，‑20℃或‑70℃保存备用；步骤(S2)制备AS‑PCR体系，如下：10×PCR Buffer 2.5μL，浓度25mmol·L‑1的MgCl2 1μL，浓度2.5mmol·L‑1的dNTPs 0.5μL，序列为5’‑ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC‑3’浓度为10μmol·L‑1的上游引物1μL，序列为5’‑CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG‑3’浓度为10μmol·L‑1的下游引物1μL，50～100ng的DNA 2μL，浓度5U·μL‑1的Taq DNA聚合酶0.3μL，PCR反应总体积25μL；步骤(S3)AS‑PCR反应程序：预变性94℃3min；94℃变性1min，退火54℃1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min；步骤(S4)将PCR产物进行凝胶电泳及成像鉴定。