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一种半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于它的技术方法包括二个方面：（1）、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法；（2）、卵裂雌核发育鱼苗的诱导和鉴定方法；（1）、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法：它的技术内容包括：A. 雄鱼培育和精子的采集；B．精子的冷冻保存与解冻； C．精子的紫外线照射；D.未受精卵的采集及与紫外线照射精子的受精；A．雄鱼培育和精子的采集： 自人工控光、控温的亲鱼培育池中选取达到性成熟的半滑舌鳎雄鱼，采用腹部挤压法采集精液，先将雄鱼泄殖孔周围腹部的水分用毛巾擦干，用玻璃吸管吸取乳白色的精液；将采集的精液盛入25ml的干燥玻璃瓶中，将装有精液的玻璃瓶置于冰上；精液在运送途中避免光线直射；精子活力在70%以上者用于冷冻保存；B．精子的冷冻保存与解冻：采用配方为NaCl 60.05‑60.65mM, NaH2PO4 1.7‑1.9mM; NaHCO3 2.5‑3.5mM, KCl 5.1‑5.3mM, CaCl2.2H2O 1.0‑1.2mM, MgCl2.6H2O 1.0‑1.2mM, D‑Glucose 55‑56mM的精子冷冻保存液MPRS进行精子的冷冻保存，向上述冷冻保存液中添加20%的抗冻剂二甲亚砜DMSO，置于4℃冷却，将半滑舌鳎新鲜精液与上述冷却的冷冻保存液‑DMSO混合液按1：1比例混合，然后分装到2.0ml的冷冻保存管中，在4℃平衡5min后，采用三步冷冻法将精子放入液氮中冷冻保存；冷冻精子解冻时，先将盛冻精的冻存管从‑196℃液氮中提到‑160℃—‑180℃的液氮蒸汽中平衡5分钟，然后将冻存管放在38℃‑40℃水浴中进行快速解冻；C. 精子的紫外线照射：刺激半滑舌鳎卵子进行卵裂雌核发育的精子用新鲜的或冷冻保存的同源精子或异源精子；当精子活力达到60%以上者用于紫外线灭活处理；精子的紫外照射条件为：将50μL新鲜的或100μL冷冻解冻的精液用1‑1.2mL精子稀释液MPRS稀释，平铺于培养皿中，将培养皿置于UVC500紫外交联仪中，用40‑70 mJ/cm2 紫外线照射，照射后精子的活力保持在20‑35%；然后与半滑舌鳎卵“授精”，刺激卵子进行雌核发育；精子稀释液MPRS的配方为：KCl 0.39 g/L，CaCl2 2H2O 0.17 g/L，NaHCO3 0.25 g/L，NaCl 3.59 g/L，NaH2PO4 0.22 g/L,MgCl2 0.23 g/L，Glucose 1.0 g/L；D. 半滑舌鳎未受精卵的采集及与紫外线照射精子的授精：选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，在产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入250‑500ml干燥的烧杯中，置于20‑23℃室温下；将以上经过紫外线照射的精液加入半滑舌鳎卵中，轻轻摇动混匀，然后加入温度为20‑23℃的2倍于卵量的海水完成“受精”过程；授精后将卵置于20℃‑23℃海水中进行孵化；（2）、卵裂雌核发育鱼苗的诱导和鉴定方法：包括：A、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；B、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法；A、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；它的技术内容包括： a、雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定；b、静水压压力和处理持续时间的确定；a．雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定： 染色体加倍采用静水压方法进行；在“授精”后15.5‑42.5min，将卵倒入静水压机的压力缸中，采用60‑70 Mpa的压力进行压力休克处理，处理时间为4‑6分钟；休克处理完毕后将卵移入21‑23℃海水中培养，统计雌核发育二倍体率；结果发现雌核发育卵在“授精”后21‑25min进行静水压休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以“授精” 后21.5‑24.5 min的诱导率最高；因此，卵裂雌核发育诱导的静水压休克处理的有效起始时间确定为“授精”后21.5‑24.5 min；b．静水压压力和处理持续时间的确定：在确定了静水压休克起始时间后，需要确定静水压压力和和休克持续时间；将与紫外失活精子“授精”的卵，在授精后4‑6分钟，分别采用50、60、70和80 Mpa压力进行处理，在每个压力下分别处理2min，4min和6min；统计雌核发育鱼苗的孵化率；结果表明在休克压力60‑70Mpa，处理4‑6min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在65‑‑70Mpa处理4‑6 min的雌核发育诱导率最高；因此确定半滑舌鳎卵裂雌核发育诱导的静水压有效压力为65‑70Mpa，有效处理持续时间为4‑6分钟；B、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法:采取高盐法和Omega 公司的E.Z.N.A.TM MicroElute Genomic DNA 试剂盒提取半滑舌鳎雌核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA，采用筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星标记进行雌核发育鱼苗鉴定；共使用10对微卫星引物：Cyse147（5‑ACCCAAAGCAAACACAAAGG‑3‘；5’‑GATCGATGGGTGGATAGCAC‑3‘），Cyse17（CTTGGGGGCTTAGCTCTTCT；ACTCACTCCGCTGAGGTTTG），Cyse149（CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT；CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT），Cyse215（AATGCAGACGGACAAACAAA；GGCCTGGTGAACAAAACATC ），Newcyse18（TCACCATCTCTGTCCCTGTG；CATTGAAACAAGCCCTGAAA），Newcyse56（TAGCACTACCCCAGGTCCAG；TTGAAAACACGCCAACAGTC），Newcyse91（GCTGCCTTCAAATGACACAA；TCACCACTGTTCTGCTCCAC），Newcyse97（CCATGTCGTGTGCAAATGTT；TTTTCAGGAAATGCAGCACA），Newcyse104（TGCACCAGTCTGAGGAAGTG；CCCAGTCTCCCTACGATGAA），Newcyse105 （CCCAGTCTCCCTACGATGAA；CGATCTTCGCATCGCTACTT）；采用上述引物进行PCR扩增的条件为94℃热变性 5min, 然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s, 58‑60℃退火30s,72℃延伸30s,最后在72℃延伸7min；PCR扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，采用银染法染色；采用上述10对微卫星标记分析表明，24个卵裂雌核发育鱼苗有效等位基因数为1.31‑2.08，观测杂合度为Ho 0.1250‑0.304，期待杂合度为He 0.2406‑0.5293；24尾后代中纯合子比例73.91‑87.50，平均纯合子比例为80.54%，杂合子比例仅为19.46%；同时，采用上述引物对获得的24尾减数雌核发育鱼苗进行分析表明，平均纯合子比例仅为13.35%，而杂合子比例高达86.65%；由此表明，当雌核发育鱼苗的平均纯合度达到80%左右时，认为是卵裂雌核发育鱼苗。 |
