从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺

摘要

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺。将Exendin-4高产工程菌株经细菌培养、非变性亲和层析、用肠激酶去除N端融合肽步骤得到纯化的Exendin-4。和现有技术相比，本发明对裂解液和洗脱液的配方作出了改进，采用梯度洗脱工艺，从而增加了目的蛋白的产量和纯度，另外本发明简化了操作程序，操作步骤简便易行，适合工业化大批生产。

主权项

一种从大肠杆菌中制备纯化Exendin‑4的工艺，其特征在于它是按下述步骤进行的：(一)Exendin‑4高产工程菌株的构建方法：(1)经改造得到如SEQ ID No.1所示Exendin‑4基因；人工合成Exendin‑4基因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC 3′为正向引物，以5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3′为反向引物，在SEQ ID No.I所示的Exendin‑4基因5′端加上限制性内切酶Kpn I识别位点；在Kpn I识别位点后添加编码肠激酶识别位点DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识别位点的核酸序列与Exendin‑4基因紧密相连；在SEQ ID No.I所示的Exendin‑4基因3′端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶Nco I识别位点CCATGG；(2)克隆载体pMD19‑T‑Exendin‑4的构建：利用PCR扩增步骤(1)所述的改造后的Exendin‑4基因，纯化后与pMD19‑T载体连接，构建克隆载体pMD19‑T‑Exendin‑4；(3)高效表达载体pET‑32a(+)‑Exendin‑4的构建：用限制性内切酶Kpn I和Nco I双酶切pMD19‑T‑Exendin‑4质粒，回收目的片断；用限制性内切酶Kpn I和Nco I消化表达载体质粒pET‑32a(+)，回收载体pET‑32a(+)大片段，将二者连接即得到重组Exendin‑4表达载体pET‑32a(+)‑Exendin‑4；将表达载体pET‑32a(+)‑Exendin‑4转化入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin‑4高产工程菌株BL21(DE3)pLYS‑pET‑32a(+)‑Exendin‑4；(二)从大肠杆菌中制备纯化Exendin‑4的工艺：(1)一个单克隆接种于200ml AMP‑LB培养基，25℃过夜静置培养12h；然后在37℃，220rpm条件下培养至菌液OD600达到0.6后，置于冰上冷却，加入IPTG至浓度为1mM，在30℃、220rpm条件下诱导6h，收获菌液于‑20℃保存备用；(2)将步骤(1)保存的菌液于冰上融化后，每克细菌用10ml裂解液悬浮沉淀，冰浴30min，超声波破碎；所用裂解液的组成为：50mM NaH2PO4、500mM NaCl、10mM咪唑、0.01％ Trition 100、2％甘油、10mMβ‑巯基乙醇、0.1％ PMSF、1mM MgCl2、1U RNase、1U DNase；(3)将上述裂解液于4℃，8000rpm离心30min；取上清液与Ni‑树脂按2∶1混合，4℃缓慢振荡吸附3h；4℃，3000rpm离心5min，弃去上清；(4)向步骤(3)的树脂中加入细菌裂解液4倍体积的漂洗缓冲液，4℃缓慢振荡30min；4℃，3000rpm离心5min，弃上清；用1倍细菌裂解液体积的漂洗缓冲液重悬浮树脂，转移到层析柱中；收集漂洗缓冲液最后1.5ml，用于鉴定洗液中是否还有杂蛋白；漂洗缓冲液组成为：50mM NaH2PO4；500mMNaCl；20mM咪唑；pH 8.0；(5)先用洗脱液I以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液I；再用洗脱液II以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液II得到纯化融合蛋白；所用洗脱液I的组成为：50mM NaH2PO4、500mM NaCl、40mM咪唑、2％甘油、10mMβ‑巯基乙醇；所用洗脱液II的组成为：50mM NaH2PO4、500mM NaCl、80mM咪唑、2％甘油、10mMβ‑巯基乙醇；所用洗脱液I的体积为11ml，收集6.5ml后，再分部收集3管，每管1.5ml；所用洗脱液II的体积为9ml，每管1.5ml，共收集6管；(6)每3mg重组Exendin‑4加入1U肠激酶，4℃消化6h，将酶消化液与Ni‑树脂混合后吸附3h后，过层析柱得到的洗脱液即为纯化的Exendin‑4溶液。