牛iPS细胞拟胚体的制作方法

摘要

本发明公开了牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括牛胎儿成纤维细胞的培养、牛iPS细胞的诱导和培养及鉴定、牛iPS细胞的拟胚体制作、牛iPS细胞的拟胚体悬浮培养和牛iPS细胞的拟胚体体外分化能力检测。该制作方法形成的牛iPS细胞拟胚体避免了传统拟胚体的悬滴操作、拟胚体组成细胞纯度高、拟胚体组成细胞体外分化能力强等特点，结果显示了牛iPS细胞拟胚体的制作方法具有实用性强、易操作和推广等优点。

主权项

一种牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括如下步骤：(1)细胞培养和慢病毒感染取妊娠约2.5和4月龄牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖DMEM培养液分别建立牛胎儿成纤维细胞系；磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白Oct4、Sox2、c‑Myc、Klf4慢病毒表达载体及其包装组分在293T细胞中构建成限定因子慢病毒，12‑16h后更换新鲜培养液，病毒包装48h后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为1.04×104/cm2，添加含终浓度为10μg/ml Polybrene高糖DMEM培养液，第1次病毒感染后第2d更换含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，连续感染4次，每次间隔24h，细胞克隆形成后，1mg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液进行培养；诱导形成的牛iPS细胞经免疫荧光和碱性磷酸酶染色检测验证；(2)拟胚体的制作取牛iPS细胞用PBS洗涤，加入1mg/ml Dispase放置于培养箱消化10min，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿培养箱中培养；(3)拟胚体的悬浮培养接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养；(4)拟胚体的贴壁培养拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后即可用于体外三胚层分化能力检测。