肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法

摘要

肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，它涉及nifH基因的克隆与表达方法。方法：提取肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA；PCR扩增获得目的基因nifH，与载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；提取质粒，双酶切后构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；然后接种到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，获得培养菌液；然后加入到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，然后加IPTG培养，进行诱导表达；通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现即完成。本发明对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。

主权项

肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB‑IV‑004的菌液，以12000r/min离心1min，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA；二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18‑T载体连接，获得重组质粒pMD18‑T‑nifH；三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18‑T‑nifH和pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18‑T‑nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a‑nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a‑nifH的大肠杆菌；四、将含有质粒PET28a‑nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；五、取200μL培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，在20℃、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；六、诱导表达后的菌液通过SDS‑PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB‑IV‑004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB‑IV‑004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物p1的核苷酸序列为：5′‑GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG‑3′，引物p2的核苷酸序列为：5′‑CATATGATGACCATGCGTCAATGCG‑3′；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每1000mL由50μg的卡那霉素、10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成。