一种利用荒漠旱生植物霸王H+-PPase和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因培育耐盐抗旱百脉根的方法

摘要

本发明属于分子生物学和生物技术领域，提供了一种强耐盐抗旱植物品种的培育方法：通过构建双基因植物表达载体实现中亚荒漠特有种属——多浆强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的液泡膜氢焦磷酸酶(H+-PPase)基因ZxVP1-1和液泡膜钠氢逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporter)基因ZxNHX聚合，然后经过一次转化即可实现耐盐抗旱功能协同的两个基因在转化植物品种(系)中连锁超表达，从而培育出强耐盐抗旱植物品种。其优点是：①转双基因植物的耐盐抗旱性强于转单基因的植物；②大大加速了培育强耐盐抗旱植物的育种进程；③植物后代的耐盐抗旱性状稳定。本发明主要用于农作物和优良牧草的遗传改良，可以提高其耐盐、抗旱、抗寒和产量等性状，具有重要的社会、经济和生态效益。

主权项

一种利用荒漠旱生植物霸王H+‑PPase和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因培育耐盐抗旱百脉根的方法：(1)霸王H+‑PPase基因ZxVP1‑1和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX双价表达载体pCAMBIA1302‑ZxVP1‑1‑ZxNHX的构建方法，其主要步骤为：(a)构建霸王H+‑PPase基因ZxVP1‑1的表达载体pCAMBIA1302‑ZxVP1‑1，其特征为：利用ZxVP1‑1的特异性引物：上游引物5’‑CCATGGTTGTGAAGATGGGTCAGGTGAAAGATAGCC‑3’、下游引物5’‑TTACCGTGTATGTGTAGACTGTAGAGCAATGGC‑3’，以霸王叶总RNA反转录成cDNA，进行PCR反应，扩增到该基因完整的开放阅读框，将其连接到pMD19‑T SimpleVector载体上，获得pMD19‑T‑ZxVP1‑1载体，用优选的限制性内切酶NcoI和PspEI从上述载体中切下ZxVP1‑1开放阅读框，连接到相同酶切的pCAMBIA1302二元表达载体，获得ZxVP1‑1的表达载体pCAMBIA1302‑ZxVP1‑1；(b)构建植物表达载体pCAMBIA1300RBS，其特征为：表达载体pCAMBIA1300RBS是由植物表达载体pCAMBIA1300和克隆载体pUC19‑35S‑FLAG‑RBS改造而成，用优选的限制性内切酶EcoRI和SacI从克隆载体pUC19‑35S‑FLAG‑RBS中切下CaMV35S片段，连接到相同酶切的pCAMBIA1300载体上，获得中间载体pCAMBIA1300MV，再用限制性内切酶PstI和HindIII从克隆载体pUC19‑35S‑FLAG‑RBS中切下rbs‑s‑3’片段，连接到相同酶切的pCAMBIA1300MV载体上，获得含有CaMV35S和rbs‑s‑3’片段的植物表达载体pCAMBIA1300RBS；(c)构建霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX的表达载体pCAMBIA1300RBS‑ZxNHX，其特征为：利用ZxNHX的特异性引物：上游引物5’‑GGATCCTGAGGATTGACTCGGAAAGG‑3’、下游引物5’‑CGATTGTCGACCAGGCACGAAGATCTG‑3’，以霸王叶总RNA反转录成cDNA，进行PCR反应，扩增到该基因完整的开放阅读框，将其连接到pMD19‑T SimpleVector载体上，获得pMD19‑T‑ZxNHX载体，用限制性内切酶BamHI和SalI从上述载体中切下ZxNHX的开放阅读框，连接到(b)步骤改造的载体pCAMBIA1300RBS上，获得ZxNHX的表达载体pCAMBIA1300RBS‑ZxNHX；(d)用优选的限制性内切酶EcoRI和HindIII从(c)步骤的pCAMBIA1300RBS‑ZxNHX载体中切下CaMV35S‑ZxNHX‑rbs‑s‑3’，连接到(a)步骤的pCAMBIA1302‑ZxVP1‑1载体上，获得ZxVP1‑1和ZxNHX的双价表达载体pCAMBIA1302‑ZxVP1‑1‑ZxNHX；(2)强耐盐抗旱转基因植物的培育方法，其主要步骤为：(a)将上述(1)步骤的双价表达载体pCAMBIA1302‑ZxVP1‑1‑ZxNHX电转化到根癌农杆菌GV3101，以获得工程农杆菌；(b)通过(a)步骤的工程农杆菌将上述(1)步骤的双价表达载体中的所含基因ZxVP1‑1和ZxNHX转入百脉根细胞或组织或种子；(c)将(b)步骤的百脉根细胞或组织或种子进行再生培养，获得完整的植株。