一种检测土壤纤维素酶活性的分析方法

摘要

本发明涉及一种检测土壤中纤维素酶活性的分析方法：1)称取筛分的土壤风干样品n份于n支粗试管中，向各试管中加入醋酸缓冲溶液，使用旋涡振荡器振荡，在振荡条件下取土壤悬液至96微孔板(占有n个微孔)，向n-1个孔中加入4-MUB-7-β-D-纤维二糖苷底物溶液，另一孔中加入等量水作为无底物对照，向第n+1个孔中加入等量底物溶液和等量水作为无土壤对照，恒温条件下振荡培养；2)培养结束后向微孔板中加入NaOH终止反应；3)多功能酶标仪对反应产物进行荧光测定；4)计算纤维素酶活性。本发明的优点为：1)与传统方法相比，减短了培养时间，省略了过滤等操作程序，简化了操作步骤；2)微孔板内的荧光物质可通过多功能酶标仪在15s内同时获得测定数据，允许大量样品同时进行测定；3)准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。

主权项

一种检测土壤中纤维素酶活性的分析方法，其特征在于：1)以已知系列浓度的MUB溶液为标准物，采用酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；作为测定的标准曲线；以MUB标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A`制作工作标准曲线，得到斜率b；2)分别称取n份3‑5g过1‑2mm筛的土壤风干样品于n支粗试管中，n为≥3的正整数，向各试管中加入30‑50ml 0.45‑0.55mol·L‑1pH5.0‑6.0的醋酸缓冲溶液，使用微量进液枪在旋涡振荡条件下取100μl土壤悬液加入微孔板中，占有n个微孔，向n‑1个孔中加入10mM 4‑MUB‑β‑D‑纤维二糖苷100μl，另一孔中加入100μl水作为无底物对照，向第n+1个孔中加入100μl底物溶液和100μl水作为无土壤对照；25℃‑30℃条件下振荡培养2.5‑3.5h；分别向孔内加入100μl 2‑2.5mol·L‑1NaOH终止反应；3)将微孔板置入多功能酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；在多功能酶标仪上测定荧光度为A；4)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中MUB的浓度S，S＝A*b；5)根据MUB的量计算出酶活性；计算公式为：x＝[S*(30‑50)]/(V*b*T)式中：x为纤维素酶活性单位：μmol MUB·g‑1·h‑1，S为步骤4所获得的荧光物质的浓度，V为反应体系内的溶液总体积单位ml，b为称取的土壤重量单位：g，T为培养时间单位：h，所述MUB为4‑羟甲基‑7‑香豆素。