土壤中弓形虫的分子检测方法

摘要

本发明属于寄生虫分子检测技术领域，涉及一种土壤中弓形虫的分子检测方法，尤其涉及一种利用环介导的等温扩增(LAMP)技术快速检测土壤环境中弓形虫卵囊的方法。本发明的特征是，通过设计一套弓形虫的特异性引物，提取被检土壤样品中总DNA，LAMP扩增，采用显色方法或琼脂糖凝胶电泳方法对扩增产物进行鉴定分析，判定所述样品中弓形虫是否为阳性或阴性。本发明的另一特点是在所述的LAMP反应体系中添加了牛血清白蛋白(BSA)，从而降低了土壤环境中PCR抑制因子对LAMP反应的干扰，提高了检测的准确率。本发明能快速、准确地将被检土壤样品中的弓形虫检测出来，同时适用于动物弓形虫感染的检测以及环境中弓形虫的监测。

主权项

一种土壤中弓形虫的分子检测方法，其特征在于，通过设计弓形虫特异引物对，提取被检土壤样品总DNA，采用环介导的等温扩增，对扩增产物进行分析以判定待测土壤样品中所述弓形虫是否为阳性或阴性，其步骤如下：(1)根据报道的登录号为EU572718的弓形虫MIC3基因序列设计特异引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：外引物对F3：5’‑TAGATGTATTGATGACGCCTCG‑3’；外引物对B3：5’‑TATTCATTTTTTCACTCAAGCTCC‑3’；内引物对BIP：5’‑AATTCGGCATCAGCGCGTCCCCCGATTCTCCTTTCCCAT‑3’；内引物对FIP：5’‑GACTTCGACTCCTTCCACACACGGAGAATGCTACACCTGCGAGT‑3’；促环形成引物对LF：5’‑CTCCGCCTTGAAGTCACTC‑3’；促环形成引物对BF：5’‑GATCTGCTTCCGCAACCTCC‑3’；(2)待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合并自然晾干，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草；(3)待检土壤样品中DNA的提取：1)将处理过的0.5g的土壤与0.5g的直径为0.5mm的玻璃珠混合加入pH为8.0的2mL裂解缓冲液涡旋3min直至土壤样品被打散，在70℃下水浴1h；2)将步骤1)的土壤样品在5000r/min下离心10min，保留上清备用；3)将步骤2)的沉淀用DNA提取液洗一次，于12000r/min下离心10min，幷将得到的沉淀溶于1.5mL的DNA提取液中，得到混合物；4)将步骤3)的混合物分别置于‑20℃及65℃下水浴，循环3次，于12000r/min下离心10min后取清并与步骤2)的上清合并；5)用体积比为25∶24∶1的等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液抽提2次，取水相加等体积的异丙醇沉淀；6)将步骤5)的样品在12000r/min下离心10min，用100μL灭菌水溶解沉淀；7)用DNA纯化柱纯化DNA样品；(4)环介导的等温扩增：1)建立环介导的等温扩增反应体系：2.5μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，7.0mmol/L MgCl2，1.0ng/μL牛血清白蛋白，1mol/L甜菜碱，1.4mmol/L脱氧核苷酸，0.3μmol/L的引物F3和引物B3，1.6μmol/L的引物FIP和引物BIP，0.8μmol/L的引物LF和引物LB，8U的BstDNA聚合酶，2μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL，其中阳性对照为土壤中提取的弓形虫DNA，阴性对照为灭菌双蒸水；2)环介导的等温扩增条件：95℃预变性5min后加入8U的BstDNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63.5℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应；3)扩增产物分析：采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，所述的显色反应的步骤为：加入1‑2μL的荧光显色剂1000×SYBR Green I至25μL的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果，若扩增产物变为黄绿色则为弓形虫阳性，若扩增产物为棕色则为弓形虫阴性；所述的琼脂糖凝胶电泳步骤为：取25μL的环介导等温扩增的最终反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果，扩增产物为由不同大小的区带组成的阶梯式图谱为弓形虫阳性；其中步骤(3)的1)中的裂解缓冲液的组分及配比为：pH为8.0的50mmol/L Tris，20mmol/L的EDTA，100mmol/L的NaCl，1％十二烷基硫酸钠，补足双蒸水至1L；步骤(3)的3)中DNA提取液的组分及配比为：pH为8.0的50mmol/L的Tris，20mmol/L的EDTA，100mmol/L的NaCl，补足双蒸水至1L。