一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法

摘要

一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法，利用该方法可以成功解决外源基因难以导入大豆的难题。本发明以大忆豆下胚轴切段为外植体，用含有外源基因的根癌农杆菌浸染后共培养，将共培养后的外植体经过转基因愈伤组织的诱导和筛选后统计转基因愈伤组织的转化效率高达87.7％。该转化方法的外植体制备简单、实验流程短、转化效率高。该大豆转基因愈伤组织转化体系的建立，在大豆生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大豆基因工程、细胞工程、代谢工程以及大豆遗传转化体系的建立等方面有广泛的应用价值。

主权项

一种快速获得大豆转基因愈伤组织的转化方法，具体包括以下步骤：第一步：外植体的制备首先将成熟的大豆种子用氯气熏蒸消毒2.5‑5小时，然后将种子浸泡于含有0.8‑1.5mg L‑16‑BA的无菌水中，28℃黑暗条件下萌发10‑18小时之后，去除种皮、子叶、原叶和胚根，剩余的下胚轴切段作为待转化的外植体；第二步：农杆菌工程菌液的制备及浸染将含有外源基因的农杆菌LBA4404单菌落接种于YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养12小时；然后以1/100的比例扩大培养；待菌液的浓度达到OD600＝0.8后，4℃、4000rpm离心12分钟收集菌体，并将菌体重悬于液体浸染培养基中至OD600＝0.5，将上步制备好的外植体浸泡于菌液中浸染30分钟；所述的农杆菌浸染外植体使用的液体浸染培养基组分如下：KNO3250mg L‑1，CaCl2·2H2O 15mg L‑1，MgSO4·7H2O 25mg L‑1，(NH4)2SO413.4mg L‑1，NaH2PO4·H2O 15mg L‑1，KI0.075mg L‑1，H3BO40.3mg L‑1，MnSO4·4H2O 1.0mg L‑1，ZnSO4·7H2O 0.2mg L‑1，Na2MoO4·2H2O0.025mg L‑1，CoCl2·6H2O 0.0025mg L‑1，CuSO4·5H2O 0.0025mg L‑1，Na2‑EDTA 3.73mg L‑1，FeSO4·7H2O2.78mg L‑1，肌醇100mg L‑1，烟酸1.0mg L‑1，盐酸吡哆醇1.0mg L‑1，盐酸硫铵素10mgL‑1，蔗糖30g L‑1，MES0.6g L‑1，6‑BA2.0mg L‑1，IBA0.2mg L‑1，0.04g L‑1乙酰丁香酮，pH5.4；第三步：外植体与农杆菌共培养将第二步经过农杆菌浸染后的外植体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的半固体共培养基上，24℃黑暗培养3天；所述的半固体共培养基组分如下：KNO3250mg L‑1，CaCl2·2H2O 15mg L‑1，MgSO4·7H2O 25mg L‑1，(NH4)2SO413.4mg L‑1，NaH2PO4·H2O 15mg L‑1，KI 0.075mg L‑1，H3BO40.3mg L‑1，MnSO4·4H2O 1.0mg L‑1，ZnSO4·7H2O 0.2mg L‑1，Na2MoO4·2H2O 0.025mg L‑1，CoCl2·6H2O 0.0025mg L‑1，CuSO4·5H2O 0.0025mg L‑1，Na2‑EDTA 3.73mg L‑1，FeSO4·7H2O 2.78mg L‑1，肌醇100mg L‑1，烟酸1.0mg L‑1，盐酸吡哆醇1.0mgL‑1，盐酸硫铵素10mg L‑1，蔗糖30g L‑1，MES0.6g L‑1，6‑BA2.0mg L‑1，IBA0.2mg L‑1，L半胱氨酸0.4g L‑1，DTT 0.15g L‑1，Na2S2O30.25g L‑1，乙酰丁香酮0.04g L‑1，琼脂粉5g L‑1，pH5.4；第四步：转基因愈伤组织的诱导将第三步共培养3天的外植体切口向下转于转基因愈伤组织诱导培养基上，25℃、光照强度100μE m‑2s‑1、16h光/8h暗的光周期条件下培养10天；所述的转基因愈伤组织诱导培养基为：MS基本培养基+蔗糖30g L‑1+2，4‑D 2.0mg L‑1+6‑BA 0.5mg L‑1+MES 0.6g L‑1+潮霉素10mgL‑1+头孢霉素400mg L‑1+琼脂粉7g L‑1，pH5.8；第五步：转基因愈伤组织的筛选及继代待转基因愈伤组织初步形成后，将其转入转基因愈伤组织筛选培养基上，两周后将其从外植体的两端切下，转入相同的转基因愈伤组织筛选培养基上继续筛选，以后每隔两周，便将形成的转基因愈伤组织切成2mm的小块，转入新鲜的转基因愈伤组织筛选培养基上继代培养一次来保持转基因愈伤组织的旺盛生长；所述的转基因愈伤组织筛选培养基为：MS基本培养基+蔗糖30gL‑1+2，4‑D2.0mg L‑1+6‑BA 0.5mg L‑1+MES 0.6g L‑1+潮霉素50mg L‑1+头孢霉素400mgL‑1+琼脂粉7g L‑1，pH5.8。