一种提高小麦纹枯病抗性的方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及通过采用基因工程方法将天麻的抗真菌蛋白基因和兔防御素基因导入常规小麦并表达，增加小麦的纹枯病抗性；一种提高小麦纹枯病抗性的方法，在于以下步骤：构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体pAHC-NP-GAFP；通过基因枪法将pAHC-NP-GAFP导入受体小麦幼胚细胞，对小麦幼胚细胞愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株，通过分子检测，获得阳性转基因植株，阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T5代转基因纯合株系；对T5代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选；筛选出纹枯病抗性提高的转基因植株。其优点在于：与常规的种质培育方法相比，具有针对性强、培育周期短、对重要农艺性状影响小的特点。

主权项

一种提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于以下步骤：a、构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体pAHC‑NP‑GAFP；b、通过基因枪法将天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因表达载体pAHC‑NP‑GAFP导入受体小麦幼胚细胞；c、对所述的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株；d、对上述转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株，阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T5代转基因纯合株系；e、对T5代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选；f、筛选出纹枯病抗性提高的转基因植株；所述的天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体pAHC‑NP‑GAFP通过以下步骤获得：A、制备质粒pAHC‑NP：以pAHC25为基础质粒，采用限制性内切酶XbaI和BglII对pAHC25质粒DNA进行部分酶切，切除质粒含有的bar基因，0.8％琼脂糖电泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，以T4DNA连接酶与seq1连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后的大肠杆菌DH5α细胞悬液涂布含100mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC‑NP；B、制备pAHC‑NP‑GAFP表达载体：pAHC‑NP质粒DNA采用限制性内切酶SmaI和SacI完全酶切，切除质粒含有的GUS基因，0.8％琼脂糖电泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，以T4DNA连接酶与Seq2连接，转化大肠杆菌，对抗100mg/L氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC‑NP‑GAFP即为天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体；所述的seq1为ATG GTT GTT TGT GCA TGT AGA CGT GCA CTT TGT TTA CCA CGT GAA CGT CGT GCA GGT TTT TGT AGA ATT CGT GGT AGA ATT CAT CCA CTT TGT TGT CGT CGT TGA；所述seq2为ATG AGG GTA CGG TTG AAT TCG GGC CAC CAA CTT GAT ACC GGG GGC TCA GTA GCA GAA GGC GGC TAC CTA TTC ATA ATA GAA AAC GAT TGT AAT CTT GTC TTA TAT GAT AAC AAC AGA GCG GTA TGG GCA TCA GGA ACC AAC GGA AAG GCC TAT GGC TGT GTG CTT AAG ATG CAG AAT GAT GGC AAC CTC CTT ATT TAT AGC GGT AGC AGG GCA ATA TGG GCA AGC AAC ACC AAT CGC CAA AAC GGT AAC TAC TAT CTG ATC CTT CAG AGA GAT CGT AAC GTC GTC ATA TAC GAT AAT TCT AAT AAT GCG ATT TGG GCA ACC CAC ACC AAC GTT GGA AAT GCT GAA ATC ACT GCC ATC CCA CAC AGC AAC GGC ACA GCG GCG GCG TCT GGC TGA。