主权项 |
一种MHV混合细胞分离培养多种病毒的培养方法,其特征在于,其包括步骤:1)选择培养试剂细胞生长液为MEM母液加小牛血清,终浓度为10%,加庆大霉素,终浓度24ug/ml,7.5%NaHCO3调pH至7.0~7.2;病毒运输液为MEM母液加牛血清白蛋白,终浓度5ug/ml,加青、链霉素终浓度100ug/ml,加两性霉素终浓度0.5ug;病毒接种液为MEM母液加牛血清白蛋白终浓度5ug/ml,加青、链霉素终浓度50ug/ml,TPCK‑胰酶终浓度为2ug/ml;2)制备培养细胞:5~15代MDCK细胞、HEP‑2细胞和Vero细胞,分别在T75细胞瓶中长成单层细胞;3)制备MHV混合细胞瓶采用MDCK、Hep‑2、Vero细胞制备混合细胞培养瓶,分离培养呼吸道病毒中的甲型、乙型流感病毒、腺病毒;肠道病毒中的EV71病毒;4)标本接种:鼻咽拭标本处理:鼻咽标本4℃、2000r/min离心5min去除沉淀,0.22微米孔径滤膜过滤除菌或以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶,同时设立阴性对照;粪便标本处理:粪便标本以1∶5比例悬浮于pH7.2PBS液,2000r/min离心5min去除粪便渣,0.22微米孔径滤膜过滤除菌再以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶,同时设立阴性对照;5)培养物鉴定:接种标本24h以后,在倒置显微镜下观察培养细胞致细胞病变效应、荧光显微镜下观察特异蛋白单克隆免疫荧光染色、RT‑PCR、PCR扩增产物鉴定。 |