靶向性WWOX基因重组腺病毒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种靶向性WWOX基因重组腺病毒及其制备方法和应用，该重组腺病毒含有一个WWOX基因表达盒，所述WWOX基因表达盒包含Survivin启动子、WWOX基因和终止子，所述WWOX基因的表达由Survivin启动子调控；本发明的重组腺病毒能够有效并且特异地诱导肿瘤细胞的凋亡并抑制肿瘤细胞的克隆，能够有效抑制肿瘤细胞的生长，同时能够延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率；该重组腺病毒还具有转染效率高，稳定性好，肿瘤治疗谱广，制备方法简单等优点，可用于制备抗肿瘤药物，在肿瘤基因治疗领域有着良好的开发应用前景。

主权项

靶向性WWOX基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于：所述重组腺病毒含有一个WWOX基因表达盒，所述WWOX基因表达盒包含Survivin启动子、WWOX基因和终止子，所述WWOX基因的表达由Survivin启动子调控；其制备方法包括以下步骤：a、Survivin启动子的克隆：根据Survivin基因启动子片段的核苷酸序列设计并合成引物，以人喉癌Hep‑2细胞基因组DNA为模板，PCR扩增两端分别带有Xho I酶切位点和Nco I酶切位点的Survivin启动子片段，克隆入pGEM‑T载体，得重组载体pGEM‑T/SurP；所述引物序列为：上游引物：5’‑gcctcgagctggccatagaaccagagaagtga‑3’；下游引物：5’‑gcccatggccacctctgccaacgggtcccgcg‑3’；所述PCR循环条件参数为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；b、WWOX基因的克隆：根据WWOX基因的核苷酸序列设计并合成引物，将人胚胎肾293细胞总RNA逆转录为总cDNA，再以总cDNA为模板，PCR扩增两端分别带有Hind III酶切位点和BamH I酶切位点的WWOX基因，克隆入pMD18‑T载体，得重组载体pMD18‑T/WWOX；再自重组载体pMD18‑T/WWOX中用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切出WWOX基因，与同样经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)在T4DNA连接酶的作用下连接，得重组载体pcDNA3.1‑WWOX；所述引物序列为：上游引物：5’‑gggaagcttttggagcgggagtgag‑3’；下游引物：5’‑atgggatcccagcagttgttgaagtaca‑3’；所述PCR循环条件参数为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、65℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；c、Survivin启动子调控WWOX基因重组腺病毒穿梭载体的构建：自重组载体pGEM‑T/SurP中用Xho I和Nco I双酶切出Survivin启动子片段，与同样经Xho I和Nco I双酶切的重组载体pcDNA3.1‑WWOX在T4DNA连接酶的作 用下连接，得重组载体pcDNA3.1‑SurP‑WWOX；再自重组载体pcDNA3.1‑SurP‑WWOX中用Xho I和BamH I双酶切出SurP‑WWOX片段，与同样经Xho I和BamH I双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle在T4DNA连接酶的作用下连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle‑SurP‑WWOX；d、Survivin启动子调控WWOX基因重组腺病毒载体的构建：将重组腺病毒穿梭载体pShuttle‑SurP‑WWOX用Pme I酶切线性化后，与腺病毒骨架载体pAdEasy‑1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd‑SurP‑Apoptin；e、Survivin启动子调控WWOX基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化：用脂质体法将重组腺病毒载体pAd‑SurP‑Apoptin转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病毒Ad‑SurP‑Apoptin原液；将病毒原液再感染293细胞以扩增病毒，所得含病毒的上清液采用氯化铯梯度离心纯化。