主权项 |
一种丙酸杆菌属菌株质粒提取的改良方法,其特征在于主要包括如下步骤:(1)取一定体积的培养菌液,4℃、10000g离心3min,去上清,得菌体沉淀;(2)用步骤(1)中菌液体积1/30‑1/10的SET洗脱液洗涤,于4℃、10000g条件下离心3min,去上清,沉淀干燥得湿重,快速冻融一次;所述SET洗脱液含0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris‑Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0);(3)加入步骤(1)中菌液体积1/30‑1/10的溶液I彻底悬浮;所述溶液I含50mmol/L葡萄糖,20g/mL Rnase A,25mmol/L Tris‑Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0);(4)加入1/10溶菌酶溶液和1/10变溶菌素溶液,37℃水浴30min;所述溶菌酶溶液为200mg/mL溶菌酶溶于Tris‑Cl(pH7.4),变溶菌素溶液为1000U/mL溶于Tris‑Cl(pH7.4);(5)加入步骤(1)中菌液1‑3体积的蛋白酶K溶液,56℃水浴30min,期间每个8‑10min混匀一次;所述蛋白酶K溶液为50mg/mL蛋白酶K溶于Tris‑Cl(pH7.5);(6)加入步骤(1)中菌液体积1/20‑1/5的新配制的溶液II,轻轻颠倒5‑6次;所述溶液II为0.2N NaOH,1%(m/V)SDS;(7)加入步骤(1)中菌液体积1/20‑1/10的冰预冷的碱裂解液III,反复颠倒数次,然后置于冰上3‑5min,于4℃、10000g条件下离心5min,将上清转移至另一离心管中;所述碱裂解液III为5mol/L乙酸钠60mL,冰乙酸11.5mL,H2O 28.5mL;(8)加入与步骤7制的的液体等体积的酚∶氯仿(1∶1V/V),剧烈振荡,于4℃、10000g条件下离心2min,转移上层水相到另一离心管中;(9)加入步骤(1)中菌液体积1/20‑1/5的异丙醇剧烈振荡,室温放置2min,于室温10000g条件下离心5min,吸除上清;(10)加1mL 70%乙醇,颠倒数次,于室温10000g条件下离心2min,除去上清;(11)用1mL TE(pH8.0)溶解沉淀,温和震荡数次,贮存于‑20℃;所述TE为100mmol/L Tris‑Cl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)。 |