一种巴马香猪体细胞克隆的方法

摘要

本发明公开了一种巴马香猪体细胞克隆的方法。方法按以下步骤进行操作：1)相关试剂的配制；2)巴马香猪体细胞的培养；3)巴马香猪体细胞的冷冻；4)冷冻体细胞的解冻；5)猪卵母细胞的采集和体外成熟培养；6)体细胞核移植及胚胎移植。本发明的有益效果是：1)加快国内转基因猪技术和人类异种器官移植的研究。2)加快了广西乃至全国畜牧业发展水平的速度。3)在学术上填补了国内空白。

主权项

一种巴马香猪体细胞克隆的方法，其特征在于，按以下步骤进行操作1)相关试剂的配制：(1)磷酸盐缓冲液DPBS的配制磷酸盐缓冲液DPBS的配制称取：DPBS粉剂9.5克/L，青霉素66μg/L，和链霉素100μg/L，超纯水定容，待药品充分溶解后，用灭菌的滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存；(2)体细胞培养液DMEM的配制：体细胞培养液DMEM的成分为：DMEM粉剂9.5g/L，44mM NaHCO3，1mM丙酮酸钠，66mg/L青霉素钠和100mg/L硫酸链霉素，体积百分浓度10％‑15％的FCS和体积百分浓度1％的非必需氨基酸；根据以上配方，将DMEM粉末溶于超纯水中，加入NaHCO3，丙酮酸钠，青霉素钠和硫酸链霉素，然后调pH至7.2‑7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，分装后储于4℃备用；使用前添加FCS和非必需氨基酸；使用前放在培养箱内预热平衡；(3)细胞传代消化液胰蛋白酶的配制：细胞传代消化液胰蛋白酶的成分为：2.5mg/ml胰蛋白酶和0.2mg/mlEDTA‑Na4；根据以上配方，取胰蛋白酶和EDTA‑Na4溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解完后，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，分装后储于‑20℃备用；(4)体细胞冷冻液的配制：体积百分浓度10‑15％ FCS的DMEM培养液中加入体积百分浓度10％ DMSO；(5)洗卵液的配制：洗卵液为改良TL‑Hepes‑PVA液，调pH至7.3‑7.4后，用滤膜孔径为0.22μm滤器过滤分装，放于4℃保存，1‑4周内用完，使用前放在35‑39℃恒温箱中预热；(6)猪卵泡液的配制：抽取猪卵巢上直径3‑8mm卵泡的卵泡液，将抽取液放入离心管中离心，收集上清液，用滤膜孔径为O.22μm的滤器过滤，分装，‑20℃至‑80℃保存备用；(7)FSH和LH储存液的配制：取TCM‑199成熟液的储存液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中，再加入FSH，充分溶解后，过滤除菌，分装，‑20℃至‑80℃保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0.5‑1.0μg/ml；取TCM‑199成熟液的储存液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中，再加入LH，充分溶解后，过滤除菌，分装，‑20℃至‑80℃保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0.5‑1.0μg/ml；(8)EGF储液的配制：称量EGF加入含BSA或者血清的TCM‑199成熟液储存液中，分装，‑20℃至‑80℃保存备用；使用时稀释，最终使用浓度为10ng/ml；(9)体外成熟液的配制：体外成熟液储液为改良的TCM‑199，其成分为：3.05mM D‑glucose，0.91mM Sodium pyruvate，26.19mM NaHCO3，0.09mM EDTA·Na4·2H2O，75μg/mlPenicillin G，50μg/ml Streptomycin，用滤孔为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存备用；使用前，在成熟液储液中添加最终使用浓度为0.57mM的半胱氨酸、最终使用浓度为10ng/ml的EGF、最终使用浓度为0.5‑1μg/ml的FSH、最终使用浓度为0.5‑1μg/ml的LH和最终使用浓度为10％的卵泡液，再次用滤孔为0.22μm的滤器过滤，分装，放入二氧化碳培养箱中平衡备用；(10)胚胎培养液的配制：采用NCSU‑23或者PZM‑3培养液用于重构胚胎的体外培养，调节pH为7.2‑7.3，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存，1‑4周内用完；(11)核移植操作液的配制：在洗卵液中添加体积百分浓度5‑15％ FCS和5‑7.5μg/ml细胞松弛素B，使用前将其放在35‑39℃恒温箱中预热；(12)融合激活液：称取0.3M甘露醇，0.1mM CaCl2·2H2O，0.1mM MgSO4·7H2O，0.5mMHepes，0.3％ BSA或者0.1g/L PVA。用超纯水定容，调整pH值7.3‑7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存，使用前在30‑39℃恒温箱中预热；(13)细胞松弛素B的配制：用DMSO溶解细胞松弛素B，分装到Eppendorf管中，‑20℃至‑80℃冻存，最终工作浓度为5‑7.5μg/ml；(14)透明质酸酶储存液的配制：透明质酸酶储存液的配制：称取透明质酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中，过滤，分装到Eppendorf管中，‑20℃至‑80℃保存；使用时稀释，使用最终浓度为1‑4mg/ml；2)巴马香猪睾丸细胞的体外培养：采集当地巴马香猪养殖场给雄性巴马香猪去势的睾丸组织，将其放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液或者生理盐水中清洗，然后用体积百分浓度为75％酒精快速清洗后，再用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液或者生理盐水中彻底清洗；在超净工作台内，把去势的睾丸组织块移到灭菌过的小瓶中，用眼科剪将其剪碎，加入磷酸缓冲液或者生理盐水，移到灭菌离心管中离心，洗涤，弃掉上清，向沉淀中加入少许DMEM培养液，移到培养皿中摊均匀，转入体积百分浓度5％ CO2、温度37℃和最大饱和湿度的培养箱中培养，第二天加入DMEM培养液；以后每2‑3天换液一次，待细胞长到70‑80％汇合时，轻轻拨掉组织块，然后将其和培养液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化，然后加入DMEM终止消化，并轻轻吹打；然后将液体移到灭菌的离心管中，离心，弃掉上清，再向离心管中加入新鲜的DMEM培养液，重悬细胞，调整浓度后，接种到培养皿中，继续培养，每2‑3天换液一次。70‑90％汇合时，将细胞传代或冷冻；3)巴马香猪睾丸细胞的冷冻：睾丸细胞体外培养长到70‑90％汇合时，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分细胞变圆部分细胞已脱壁时迅速加入DMEM终止消化，吹打至细胞完全脱壁，把细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入细胞冻存液，吹打均匀后分装到细胞冻存管内，于4℃冰箱中置0.5个小时，再放入‑80℃冰箱过夜，过夜后直接将冻存管放入液氮中；4)冷冻睾丸细胞的解冻：从‑80℃液氮中取出冻存管，快速投入30‑37℃温水中，不断摇动冻存管，待冰块全部融化后，将细胞悬液转移至离心管中，加入预热的DMEM培养液，离心清洗，然后用预热的DMEM调整到所需的细胞浓度后接种到培养皿培养；5)猪卵母细胞的采集和体外成熟培养：从当地生猪肉类加工厂收集猪卵巢，放入含有含青、链霉素的30‑37℃生理盐水或者磷酸盐缓冲液中，送回实验室，用含青、链霉素的生理盐水或者磷酸盐缓冲液冲洗，带入无菌操作室，用装有针头的注射器抽取卵巢表面直径为2～6mm的卵泡，将抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，静置0.5‑1小时，用洗卵液稀释后放在实体显微镜下，用玻璃吸管挑选带有2层以上卵丘细胞、胞质均匀的卵母细胞，在洗卵液中洗涤，用预平衡的成熟液洗涤，最后放入含FSH和LH的成熟液滴中，培养20‑22小时，然后移入不含激素的新鲜成熟液滴中继续培养20‑22小时，培养条件为：体积百分浓度5％CO2、最大饱和湿度、38.5‑39℃；6)核移植：(1)卵母细胞的准备：将体外培养40‑44h的猪卵母细胞在透明质酸酶中作用，轻轻吹打除去周围卵丘细胞，用玻璃拨卵针在实体显微镜下轻轻转动卵母细胞，挑选出胞质均匀且有极体排放的卵母细胞为核移植备用；(2)巴马香猪睾丸细胞的准备：选择3‑10代生长状态良好的细胞，去除培养液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70‑90％的细胞已脱壁时，加入预热的DMEM终止消化，轻轻吹打，然后将细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入核移植操作液，重悬睾丸细胞离心洗涤，弃上清后加入核移植操作液，重悬睾丸细胞，然后再向混合液中加入细胞松弛素B，使最终使用浓度为5‑7.5μg/ml；(3)操作滴的准备：用上述调整好的睾丸细胞悬液，做成长条型液滴，上面覆盖矿物油，将挑选出的卵母细胞放在上述长条型液滴中，在显微操作仪下去核操作；吸取中等大小圆形、表面光滑，细胞膜折光度较好的睾丸供体细胞通过透明带切口注射到透明带下方，并轻点透明带使睾丸供体细胞与卵母细胞膜接触良好，形成了重构卵；(4)重构卵的融合/激活和培养：将重构卵放在含有细胞松弛素B的胚胎培养液滴中，然后把恢复好的重构卵移到融合液中洗涤，然后进行融合/激活，融合后的重构卵用胚胎培养液洗涤，放入平衡好的含细胞松弛素B的胚胎培养液滴中培养3个小时，挑选融合好的重构卵，用胚胎培养液洗涤，然后移到胚胎培养液滴中培养，培养条件为：39℃，体积百分浓度5％CO2，最大饱和湿度，得到体细胞核移植胚胎，将体细胞核移植胚胎移植到受体雌猪体内相应部位，怀孕到期后产下体细胞克隆的巴马香猪。