一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳方法及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳方法。通过该方法可以建立小麦低分子量谷蛋白亚基的标准毛细管电泳图谱，进而形成对小麦优质亚基进行鉴定的一套完整的技术体系。根据蛋白质峰迁移时间和峰面积鉴定品种和种质、筛选优质亚基和等位基因，实现小麦品质快速改良。

主权项

一种小麦低分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳方法，包括如下步骤：（1）样品制备取小麦种子，去掉胚端，按每200mg加入1ml体积百分含量为70%的乙醇的比例进行混合，涡旋30‑60min，10000rpm离心10min，去上清；加入1ml体积百分含量为55%的异丙醇，65℃水浴30min；去上清；再加入0.1ml浓度为1%的DTT和0.1ml溶液A，其中溶液A的组成为，异丙醇：1M  pH6.8的Tris‑HCl：双蒸水=5:2:3，涡旋混匀，65℃水浴30min；再加入0.1ml浓度为1.4%的4‑乙烯基吡啶和0.1ml溶液A，涡旋混匀，65℃水浴30min；12000rpm离心15min；取上清用40%体积百分含量丙酮室温沉淀3小时，12000rpm离心15min，收集上清；将上清用80%体积百分含量丙酮在‑20℃沉淀过夜，13000g离心15min，收集沉淀，沉淀即为小麦低分子量谷蛋白亚基；在上述沉淀中加入1ml体积百分含量为99%的乙醇，搅碎，10000rpm离心10min，去上清；再加入80%体积百分含量丙酮，10000rpm离心10min，去上清；干燥沉淀，加入50µl乙腈溶液，其中含有终浓度为0.1%的TFA，将得到的上清液用于毛细管电泳；（2）毛细管电泳电泳缓冲液为100mm磷酸‑甘氨酸缓冲液，该缓冲液的pH值为2.5，添加有终浓度为18％的乙腈和终浓度为0.04％的羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为：毛细管长度： 40.2cm毛细管内径： 50μm运行电压：   11kV毛细管温度： 38℃样品槽温度： 13℃进样：       9.5 kV, 9 sec；所述100mm磷酸‑甘氨酸缓冲液的制备方法为：取85％体积百分含量的磷酸1.6ml，甘氨酸2.0g，乙腈98ml，HPMC 0.22g，加水定容至500ml，调节pH为2.5，经0.45μm滤膜过滤。