一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建方法

摘要

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其制备和应用。具体为分泌型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其构建为：以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，产物与pBS-T于室温连接，将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb，同时将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗。所得疫苗菌具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达90％。制备过程简单，无需灭活处理等步骤，且不需任何佐剂。

主权项

一种哈氏弧菌分泌型疫苗，其特征在于：其构建具体过程为，1)质粒pBSVhP1的构建：以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS‑T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有安卡青霉素(Ap)、5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑β‑D‑乳糖苷和异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，质粒为pBSVhP1；所述引物为F115’‑CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT‑3’和R85’‑CTCGAGGATATCACTGGTTGCGCGCT‑3’；2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建：将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb，同时将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2‑4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5α/pTVP1M；将表达上述所得的序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5α/pTVP1M在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至OD600为0.8‑1，而后离心收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4x108cfu/ml，即为疫苗菌悬液。