一种用于检测肝纤维化的液相芯片及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于肝纤维化检测的液相芯片，主要包括有：(1)4-plex包被微球：含有分别包被了III型前胶原(PIIIP)捕获抗体、IV型胶原及其片段(IV-C)捕获抗体、层粘连蛋白(LN)捕获抗体及透明质酸酶(HA)捕获抗体的不同颜色编码微球；(2)4-plex生物素标记检测抗体：分别用生物素标记的PIIIP、IV-C、LN、HA的检测抗体；以及(3)链亲和素藻红蛋白。本发明还公开了该液相芯片的制备方法。本发明所述的用于肝纤维化检测液相芯片具有无副作用，高通量，多指标并行检测；敏感度高，重复性好，检测快速，准确，费用低等优点。

主权项

一种用于肝纤维化检测液相芯片，其特征是，主要包括有：4‑plex包被微球：III型前胶原的捕获抗体包被的微球，IV型胶原及其片段的捕获抗体包被的微球，层粘连蛋白的捕获抗体包被的微球，和透明质酸酶的捕获抗体包被的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；4‑plex生物素标记检测抗体：分别用生物素标记的III型前胶原的检测抗体，IV型胶原及其片段的检测抗体，层粘连蛋白的检测抗体，和透明质酸酶的检测抗体；以及链亲和素藻红蛋白；所述每种捕获抗体包被微球的制备如下：‑将50μL微球活化后，≥8000g，离心；‑吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230‑280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡20s，超声20s，再将微球于≥8000g，离心1‑2min；重复该步骤；‑吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡20s，超声20s；‑往悬浮的微球中加入相应的0.8‑1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450‑550μL；‑用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5‑2.5hr；‑偶联了抗体后的微球以≥8000g的速度，离心1‑2min；‑吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡20s，超声振荡20s；‑室温避光振荡30min；再于≥8000g，离心1‑2min；‑吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡20s，超声20s；微球≥8000g，离心1‑2min；重复该步骤一次；‑吸弃上清，将微球重悬于500‑1000μL PBS‑TBN溶液中；‑每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2‑8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合；所述每种检测抗体的生物素标记：‑依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；‑配置10mg/ml的NHS‑Biotin溶液；‑按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS‑Biotin溶液；‑加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHCO3溶液；‑加入pH7.4的PBS补至目标体积；‑包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3‑5小时，转速为800rpm‑1000rpm；‑将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS‑Biotin；‑使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。