家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法

摘要

本发明公开一种家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法，包括：(1)以天蚕蛹脂肪体细胞抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到天蚕抗菌肽Cecropin B基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳对抗菌肽Cecropin B基因进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将纯化后的PCR产物克隆进TA载体pCR2.1，得到pCR2.1-Cecropin B，利用双脱氧链终止法确认克隆基因顺序正确性；(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-Cecropin B得到Cecropin B基因片段后再克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；将该重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，通过同源重组产生重组病毒：(3)使用家蚕培养细胞，接种含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒在27℃下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。

主权项

一种家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法，其特征在于包括：(1)天蚕Cecropin B基因的克隆：以天蚕蛹脂肪体细胞抽提的总RNA为模板，利用RT‑PCR扩增得到天蚕抗菌肽Cecropin B基因；所述PCR扩增所用的引物设计如下：正向引物为含有BamHI酶切位点的5’atcggatcc aaatggaaagtcttcaag 3’；反向引物为含有HindIII酶切位点的5’aagcttttatagcgct ttggcttcgcc 3’；所述PCR扩增反应为：一个循环，94℃模板变性3分钟；接着30个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后1个循环，72℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳对所述抗菌肽Cecropin B基因进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将纯化后的PCR产物克隆进TA载体pCR2.1，得到pCR2.1‑Cecropin B，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆基因顺序正确性；(2)含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1‑Cecropin B得到Cecropin B基因片段，然后将Cecropin B基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；将该重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，按以下方式通过同源重组产生重组病毒：在聚苯乙烯锥形管中加入1μg转移载体DNA和15μg家蚕BmNPV DNA，并加入14μl脂质体lipofectin后混匀，最后加入灭菌蒸馏水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总体积达到40μl；将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC‑100培养基培养24小时，再用含有10％胎牛血清的新鲜培养基在27℃条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液以用来筛选重组病毒；重组病毒通过三轮空斑筛选，获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液，该病毒溶液命名为含有抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒；(3)家蚕培养细胞表达：使用家蚕培养细胞，接种所述含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒在27℃下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。