一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色观察方法

摘要

本发明公开一种鲆鲽鱼类受精卵细胞骨架的免疫荧光显微观察技术。首先采用改进的固定液对样品进行固定，然后用解剖针将胚盘从整个胚胎中剥离出来，对样品进行打孔处理，并用硼氢化钠降低或消除未结合的醛基对实验结果的影响，再对样品进行间接免疫荧光染色，最后用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对样品进行观察。该发明的优点是操作过程简单，结果清晰度高，立体感强，可用于鲆鲽鱼类受精卵从胚盘形成到2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞等发育时期的微管骨架的动态变化研究，也适用于同属浮性卵、多卵黄的其它海水鱼类卵的免疫组化研究中，其适用范围广泛。

主权项

一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色和显微观察方法，其特征在于包括步骤如下：①采用改进的哌嗪‑N，N’‑双2‑乙烷磺酸配制的甲醛‑戊二醛固定液对样品进行固定，固定液配制为：先配制微管聚合液，其成分为80‑100mMK‑PIPES，pH 6.8‑7.0，5‑10mM EGTA，100‑200mM MgCl2，400‑500mM NaCl，于4℃保存；固定前，在微管聚合液中加入甲醛、戊二醛、Triton X‑100，加入量分别占微管聚合液浓度百分比的3.7‑4.0％、0.25‑0.5％和0.5‑1％配制成固定液；受精卵在该固定液中室温下抚育3‑6小时，磷酸吐温缓冲溶液清洗，然后在磷酸吐温缓冲溶液中于4℃下保存，待用；②在解剖镜下挑选出发育状态正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来；③在常温下用浓度百分比为1‑2％的Triton‑100对样品进行打孔处理，再在含有80‑200mM NaBH4的磷酸盐缓冲液中，室温下抚育6‑16小时；其中：磷酸盐缓冲液成分为128mM NaCl，2mM KCl，8mM NaH2PO4，2mMKH2PO4，pH 7.2‑7.4；④采用改进的间接免疫荧光染色步骤对样品进行染色，其中：抚育抗体前非特异结合位点不封闭；抚育一抗过夜，抚育二抗为避光2‑4小时；清洗液为含有155mM NaCl、10mM Tris‑Cl、pH为7.2‑7.4的Tris盐酸缓冲液，及诺纳德P‑40，其中诺纳德P‑40占Tris盐酸缓冲液浓度百分比的0.1‑0.2％；抗体稀释液含有浓度百分比为10％的山羊血清和5％的二甲亚砜的Tris盐酸缓冲液；⑤用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜进行观察。