一种人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的定量检测法

摘要

本发明公开的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法，其特征在于包括：采用同位素稀释技术，在尿样的预处理时分别加入含13C3；15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺和13C3；15N3-三聚氰酸的内标溶液；液-液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立LC-MS/MS方法分别定量检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸浓度，液相色谱以苯基、氟苯基、硅胶等填料柱为固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液为流动相，色谱分离进行等度洗脱或梯度洗脱，质谱检测采用电喷雾电离源(ESI)检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可达10ng/ml。本方法的样品处理经济、简便，检测专一性强、灵敏度高，各项方法学指标均能达到药典的相关技术要求。

主权项

一种人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的定量检测法，包括临床尿样采集、‑80℃保存和室温下解冻备用，其特征在于步骤为：(1)样品预处理：(1.1)测定人尿样中三聚氰胺：取100μl尿样，依次加入10μl 5μg/ml三聚氰胺同位素内标工作液及20μl 1N NaOH溶液，涡旋10s，加入1ml乙酸乙酯，旋涡振荡10min，18000rpm离心3min；吸取上层有机相，加入100μl含0.1％甲酸的水溶液，旋涡振荡10min，18000rpm离心3min；吸取下层水相转移至300μl塑料管进样分析，其中，三聚氰胺同位素内标为13C3、15N3‑三聚氰胺或氘代三聚氰胺；(1.2)测定人尿样中三聚氰酸：取100μl尿样，依次加入10μl 5μg/ml三聚氰酸同位素内标工作液及20μl含1％甲酸的水溶液，涡旋10s，加入1ml含5％异丙醇的乙酸乙酯溶液，旋涡振荡10min，18000rpm离心3min；吸取上层有机相，洁净空气37℃吹干，残渣加入100μL含70％甲醇的水溶液，旋涡振荡3min，18000rpm离心3min，转移至300μl塑料管进样分析，其中，三聚氰酸同位素内标为13C3、15N3‑三聚氰酸；(2)三聚氰胺和三聚氰酸分别进行液相色谱分离：(2.1)流动相：由A和B组成，流速为0.2～0.5ml/min，其中A为含0.0001～0.1％甲酸水溶液，B为含0.0001～0.1％甲酸的甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合液；(2.2)色谱柱：采用苯基、氟苯基、氰基、硅胶填料柱，色谱柱内径为1～5mm，长度为50～250mm；(2.3)洗脱方法：采用等度洗脱或梯度洗脱；(3)串联质谱测定条件：(3.1)三聚氰胺用电喷雾电离源，正离子多反应监测扫描模式，离子选择通道：定量通道m/z 127/68和定性通道m/z 127/85，内标通道为13C3，15N3‑三聚氰胺m/z 133/72，离子通道范围为±1.0amu；(3.2)三聚氰酸用电喷雾电离源，负离子多反应监测扫描模式，离子选择通道：定量通道m/z 128/42和定性通道m/z 128/85，内标通道13C3，15N3‑三聚氰酸m/z 134/44，离子通道范围为±1.0amu；(4)按内标法以峰面积或峰高法，分别计算尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。