利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法及其发酵生产丁二酸的方法。本发明通过分子生物学手段改造大肠杆菌的ATP生物合成途径，过量表达与该途径有关的酶的活性，有效的提高了大肠杆菌胞内ATP的总量，使重组大肠杆菌能够利用木糖代谢生长，大幅度提高了丁二酸的合成效率。

主权项

一种利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：（1）以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的大肠杆菌菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；(2) 单独纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及选择自苹果酸酶基因、苹果酸脱氢酶基因或丙酮酸羧化酶基因这三种基因中的一种，构建得到单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种的表达质粒；（3）将步骤（2）所述的质粒导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；（4）利用步骤（3）的阳性转化子单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌。