含CpG基序的核酸序列的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种含CpG基序的核酸序列的制备方法及应用，涉及分子生物学领域及动物免疫学领域。所述核酸序列的制备方法为：构建重组质粒pMD18-T-B1、重组质粒pMD18-T-B12、重组质粒pMD18-T-B1、重组质粒pMD18-T-B123、重组质粒pMD18-T-3B、重组质粒pMD18-T-6B、重组质粒pSP-6B；以重组质粒pSP-6B为模板，用3’端硫代修饰的随机序列5’-NpNpNpNpsNpsN-3’为引物，利用滚环扩增方法制备所述含CpG基序的核酸序列。本发明含CpG基序的核酸序列作为佐剂具有较强的免疫增强作用，其制备方法能够大规模生产所述序列而且成本低廉。

主权项

一种含CpG基序的核酸序列的制备方法，包括下列步骤：(1)重组质粒pMD18‑T‑B1的构建：将B序列克隆入pMD18‑T载体中，构建重组质粒pMD18‑T‑B1；所述B序列如SEQ ID NO：1所示；(2)重组质粒pMD18‑T‑B12的构建：以重组质粒pMD18‑T‑B1为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增，获得基因片段B1；用限制性内切酶EcoR I和Kpn I分别双酶切基因片段B1和质粒载体pMD18‑T‑B1，然后连接，构建重组质粒pMD18‑T‑B12；所述P1序列为TACGAATTCGTTCCTGACGTTGGTG，所述P2序列为CATGGTACCACGCTAACGTCTAGCC；(3)重组质粒pMD18‑T‑B123的构建：以pMD18‑T‑B12为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，获得基因序列B2；用限制性内切酶Kpn I和Xba I分别双酶切B2和pMD18‑T‑B12，然后连接，构建重组质粒pMD18‑T‑B123；所述P3序列为TATGGTACCGTTCCTGACGTTGGTG，所述P4序列为CACTCTAGAACGCTAACGTCTAGCC；(4)重组质粒pMD18‑T‑3B的构建：以pMD18‑T‑B123为模板，以P5、P6为引物进行PCR扩增，获得基因序列3B，将该序列直接与pMD‑18‑T载体连接，构建重组质粒pMD18‑T‑3B；所述P5序列为CGAATATTCTCGAGGGATCCTTCGTTCCTG，所述P6序列为CGCACATGTAGATCTCGATTACGCTAACGT；(5)重组质粒pMD18‑T‑6B的构建：用限制性内切酶BamH I和Bgl II双酶切pMD18‑T‑3B得到3B片段；用Bgl II单酶切质粒pMD18‑T‑3B，去磷酸化后与3B片段连接，构建重组质粒pMD18‑T‑6B；(6)重组质粒pSP‑6B的构建：用限制性内切酶Ssp I和Pci I双酶切质粒pMD18‑T‑6B，回收约1700bp的载体片段和约900bp的6B基因片段，将所述两片段连接后得到重组质粒pSP‑6B；(7)以重组质粒pSP‑6B为模板，用3’端硫代修饰的随机序列5’‑NpNpNpNpsNpsN‑3’为引物，利用滚环扩增方法制得含CpG基序的核酸序列；所述3’端硫代修饰的随机序列中N表示A、T、C或G，p表示磷酸二酯键，s表示硫代修饰。