一种鱼类胚胎染色体制片方法

摘要

本发明涉及到遗传工程的一种鱼类胚胎染色体制片方法，它是将原肠中期至原肠晚期的鱼卵取出100-200粒后用鱼用生理盐水清洗两次除去卵膜和卵黄后加入含有秋水仙素的1640培养液进行细胞培养，再用击打的方法使细胞混匀，最后加入固定剂固定后让其干燥直至用染色母液染色。本发明克服了传统方法费时费力，不能批量制作的缺陷，提高了制片结果的稳定性和诱导率的准确性，为鱼类的遗传育种和品种改良提供了可靠的保证。

主权项

一种鱼类胚胎染色体制片方法，其特征是：所述方法的步骤为：(1)取样：取样时间为鱼类原肠中期至原肠晚期，取样量为发育良好的鱼卵100‑200粒，放入10ml烧杯中，用0.75％的鱼用生理盐水清洗两次，清洗时用大口吸管吹打，尽量除去表面污物；(2)细胞培养和收集：样品清洗完毕后，倒掉鱼用生理盐水，加入3‑5ml含10μg/ml秋水仙素的1640细胞培养液处理45‑60分钟，所述处理期间，每隔20分钟用大口吸管吹打一次，所述处理期间，用镊子每次将多个鱼卵夹破，使胚胎细胞游离出来，鱼卵全部夹破后用大口吸管吹打成悬液，再用大口吸管将悬液转移到5ml的离心管中，转管时用100目的筛绢网过滤除去卵膜和卵黄，然后补加1640细胞培养液至5ml，离心，离心速度为700‑1000rpm/min，时间为4‑5分钟；(3)低渗：离心结束后，吸除上清液，仅留0.3‑0.5ml细胞沉淀击打均匀，击打方法为左手握紧离心管，右手食指用力击打离心管底部将细胞冲散混匀，再加入4‑5ml 0.0375mol/L氯化钾低渗液，吸打均匀，静置20‑30分钟后，加入0.5‑1ml固定剂，所述固定剂为甲醇与冰乙酸按体积比3∶1配制，再用大口吸管吹打均匀后离心，离心速度为1000rpm/min，时间为5分钟；(4)固定：吸除上清液，向留下的0.2‑0.5ml沉淀中加入0.1‑0.5ml所述固定剂，按照上述击打方法击打均匀，再加2‑3ml所述固定剂吹打均匀，静置20分钟后离心，离心速度为1000rpm/min，时间为6分钟；(5)滴片：两次上述固定操作结束后，吸除上清液，将0.1‑0.3ml沉淀按照上述击打方法击打均匀，加入所述固定剂至0.5ml，吹打均匀，取冷冻玻片使之成40‑45°角，吸取细胞悬液在冷冻玻片上滴2‑3滴，并轻轻吹动，使细胞铺散开，待其自然干燥；(6)染色：用Giemsa母液染色。