一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母及其构建

摘要

本发明公开了基因工程领域中的一种巴斯德毕赤酵母重组菌及其应用。本研究室通过体外分子进化技术，对淀粉液化芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因进行了热稳定性提高定向进化，获得多株热稳定性提高突变体。本发明首次在巴斯德毕赤酵母系统中表达了其中一株热稳定提高最明显β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，构建到AOX I甲醇诱导型启动子下游，得到重组质粒pPICZαA-his6-bgl，将其经Pme I线性化后转化毕赤酵母GS115，bgl基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上，并处于酵母α因子的下游，实现了异源分泌表达。通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH7.0，OD600为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为27KDa左右，与理论分子量大小吻合。

主权项

一株高产耐温性β‑葡聚糖酶毕赤酵母，其含有基因序列1，分类命名为：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115‑pPICZαA‑bgl，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3520。