胰岛素前体发酵过程补料优化方法

摘要

本发明的胰岛素前体发酵过程的补料优化方法，基于微生物生长动力学基础，采用首先通过分批补加甲醇来确定最初甲醇流加速率，然后通过最终发酵菌体密度与实时测样菌体密度的差值以及发酵周期来进行比生长速率的计算和调整，最后计算出实时待调整的甲醇流加速率的方法，实现了根据菌体生长状况及时调整实时甲醇流加速率的变比生长速率控制，将比生长速率与菌体生长、产物表达进行参数相关，这种变比生长速率调控策略能够及时地调整菌体的生长，使之与产物表达相协调，可以明显地提高蛋白的浓度，重组猪胰岛素前体的浓度和总产量较现有技术(Invitrogen酵母发酵手册)酵母发酵的方法提高了50％。

主权项

一种胰岛素前体发酵过程补料优化方法，其特征在于：用菌株为毕赤酵母GS115重组猪胰岛素前体发酵过程，发酵罐体积为50L，基础料4％w/v甘油作为分批发酵阶段，连续流加浓度50％w/w的甘油，待菌体密度OD600为300时，停止甘油补加，分批两次补加0.3％w/v甲醇，根据溶氧确定初始甲醇流加速率，设定最终OD600为520，发酵周期T为100h；控制目标：发酵最终OD600为520；具体步骤如下：(一)待OD600为300时，停止甘油补加，分批两次补加0.3％w/v甲醇；(二)甲醇耗尽，溶氧反弹，开始流加甲醇，并增大补加速率，使溶氧回落至反弹前溶氧最低点；，此时甲醇流加速率为最初甲醇流加速率V0＝5.24g.L‑1.h‑1；(三)取样，设时间为t0＝33h，测得菌体密度为X0OD600＝321；按照微生物生长动力学，μ＝dx/dt/X，单位时间为1h，比生长速率为μ0，则X1＝X0(1+μ0)，X2＝X1(1+μ1)以此类推……，Xn＝Xn‑1(1+μn‑1)；预计t0后比生长速率为恒定值，即μ0＝μ1＝......μn‑1，则Xn＝X0(1+μ0)n，Xn由用户设定，n＝T‑t0，可求得μ0；μ0＝(Xn/X0)1/n‑1＝(520/321)1/(100‑33)‑1＝0.007226同理，当下一取样时刻时，设时间为t0，所测得菌体密度为X0，可求得下一时刻的μ0；(四)根据计算出的比生长速率μ0，调整实时甲醇流加速率；按照底物消耗方程，ΔS＝m1X+rn2μX+m3ΔP，其中m1，m2，m3为比例系数，考虑到诱导期单位时间内产物和菌体增加都很小，忽略不计，则ΔS＝m1X，因时间单位为1h，所以ΔS即为甲醇流加速率；设取样时间为t0＝33h，所测得菌体密度为X0OD600＝321，甲醇流加速率为ΔS0＝V0＝5.24g.L‑1.h‑1，计算出的比生长速率为μ0＝0.007226，则下一时段ΔS1＝m1X1，，所以ΔS1/ΔS0＝X1/X0＝(1+μ0)，可求得下一时段的ΔS1；ΔS1＝ΔS0(1+μ0)＝5.24×(1+0.007226)＝5.28g.L‑1.h‑1同理，当再下一取样时段时，设时间为t0，所测得菌体密度为X0，可求得再下一时段的ΔS1。