一种大叶藻幼苗原生质体的制备方法

摘要

本发明公开了一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其具体步骤是：将大叶藻幼苗放入双抗海水中暂养2天；选取刚萌发的大叶藻幼苗；依次通过75％浓度的酒精、1％浓度的次氯酸钠溶液、1.5％浓度的碘化钾溶液消毒；用无菌海水冲洗、浸泡和恢复；大叶藻幼苗在离心管中加入酶液并剪碎，然后进行酶解；酶解结束后加入葡萄糖液体并过滤；用高渗海水洗3次并离心获得沉淀物；沉淀物中加入培养液离心获得原生质体。本发明能够克服污染，获得无菌大叶藻幼苗原生质体，为原生质体融合，遗传转化，植株再生，新品种培育等工作打下基础，另外，本发明也能为建立大叶藻细胞工程繁殖技术，快速繁育优良大叶藻品系，改良大叶藻遗传工程提供技术储备。

主权项

一种无菌大叶藻幼苗原生质体的制备方法，其特征在于，其步骤是：(1)将大叶藻幼苗放入双抗海水中暂养2天，温度保持4摄氏度，所述双抗海水的配方为：青霉素浓度为每毫升100单位，链霉素浓度为每毫升100单位，即1升海水需80万单位的青霉素0.06克，以及需100万单位的链霉素0.1克，通过搅拌或摇匀方法混合均匀即可获得；(2)选取种子萌发一个月的大叶藻幼苗，取鲜重为0.025克大叶藻幼苗，这时大叶藻幼苗长出两片子叶，取完整的大叶藻幼苗，并去掉大叶藻幼苗胚乳部分；(3)将暂养后的大叶藻幼苗浸泡在75％浓度的酒精10秒；(4)将大叶藻幼苗浸泡在1％浓度的次氯酸钠溶液5分钟；(5)将大叶藻幼苗浸泡在1.5％浓度的碘化钾溶液10分钟；(6)将大叶藻幼苗用无菌海水冲洗3次，再用无菌海水浸泡10分钟，然后用无菌海水恢复浸泡20分钟；(7)将大叶藻幼苗从无菌海水捞出后用无菌棉布吸干，然后将大叶藻幼苗放入离心管中并加入酶液，酶液配方为海水1000重量份，纤维素酶470重量份，果胶酶5重量份，山梨醇90重量份，再用剪刀在离心管中将大叶藻幼苗剪碎，剪碎的大叶藻幼苗在酶液中进行酶解，所述酶解条件为酶液pH值为4，温度保持15℃的条件下酶解48小时；(8)酶解结束后，向酶液中加入与含有剪碎的大叶藻幼苗组织的酶液相同体积，浓度为2摩尔/立方厘米的葡萄糖液体，然后缓慢摇匀，摇匀时间为1分钟，摇匀后树立静置20分钟，等单个的游离大叶藻幼苗原生质体细胞漂浮在液体上层，大的组织块沉在底部，通过移液枪取1.5毫升上清液，这时上清液有些浑浊，用300目的尼龙材质过滤网过滤上清液以去除沉淀杂物；(9)配置高渗海水，在过滤后的上清液中加入等体积高渗海水，用高渗海水洗3次：在上清液中加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液，获得沉淀物；在沉淀物中再次加入等体积的高渗海水摇匀后，在离心机2000r/min转速下旋转5分钟，离心后弃上清液、获得沉淀物，所述高渗海水配制比例为：消毒海水100毫升，氯化钠1.5克，氯化钙0.11克，氯化钠、氯化钙全部溶解在消毒海水后，通过不锈钢滤器在超净工作台进行抽滤，不锈钢滤器滤膜孔径为0.22微米，该消毒海水为煮沸过的海水，消毒海水煮沸时间为10分钟；(10)第3次离心获得的沉淀物中加入MS液体培养液，摇匀后用离心机在2000r/min的转速下，离心5分钟即可收集到大叶藻幼苗原生质体，所述MS液体培养液配制比例为：100毫升海水需80万单位青霉素0.006克，100万单位的链霉素0.01克，MS培养基3.474克，浓度为2毫克/升的2，4‑二氯苯氧乙酸(2，4‑D)0.25毫升，用量筒量取100毫升海水，依次添加MS培养基、青霉素、链霉素、2，4‑二氯苯氧乙酸，摇均或搅拌均匀即可得到MS液体培养液。