从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法

摘要

本发明公开了一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，包括以下步骤：将cDNA进行PCR扩增；得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；对分离得到的cDNA单链进行复性，形成具有具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链；将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序。本发明采用的测序方法能够更为有效地提高miRNA克隆测序的效率。

主权项

一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，包括以下步骤：将合成的cDNA进行PCR扩增，扩增后将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序，其特征在于：该方法在进行PCR扩增之后、PCR片段酶切之前还需要对所获得的PCR产物进行具有microRNA前体片段的不同二级结构单链分离；所述分离过程包括以下步骤：(1)将得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；(2)对步骤(1)中得到的cDNA单链进行复性，得到具有microRNA前体片段的二级结构的cDNA；(3)通过电泳分离步骤(2)中得到的cDNA，得到具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链；其中步骤(1)中PCR扩增引物为：F：5’‑AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA‑3’，R：5’‑GTCTCTAGCCGCAGGATCGATG‑3’；步骤(1)中的cDNA双链变性处理条件为95℃时5min；步骤(2)中单链复性为在以下条件下依次进行：94℃时2min，60℃时30sec，72℃时1min，4℃时5min；步骤(3)中电泳分离采用聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，电泳结束后银染。