一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏羽衣甘蓝的方法

摘要

本发明公开了一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏甘蓝的方法。本发明培育转基因甘蓝的方法包括如下步骤：用含有目的基因的重组农杆菌侵染甘蓝的子叶，再进行共培养，得到转基因甘蓝。本发明中，在选择培养基上，转化处理后外植体的不定芽诱导率达48％，每个外植体上的再生芽数平均为1-2个，经分子鉴定确认，再生芽的转化频率达35％。人工饲喂小菜蛾幼虫的结果证明，获得的转基因再生株具有抗虫性，最好的抗性材料其幼虫致死率可达97％。自外植体的转化至纯合转基因抗性材料的获得，仅需要短暂的三年时间。

主权项

一种培育转基因甘蓝的方法，包括如下步骤：用含有目的基因的重组农杆菌侵染甘蓝的子叶，再进行共培养，得到转基因甘蓝；所述共培养的方法包括如下步骤：将所述侵染后的子叶置于共培养培养基中，在温度为22℃‑27℃且黑暗的条件下培养2天；所述共培养培养基由NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O、EDTA·Na2、KI、CoCl2·6H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、MnSO4·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、肌醇、烟酸、甘氨酸、硫胺素、盐酸吡哆辛、6‑苄氨基腺嘌呤、α‑萘乙酸、蔗糖、琼脂、乙酰丁香酮和水组成；所述NH4NO3在所述共培养培养基中的浓度为1650mg/L，所述KNO3在所述共培养培养基中的浓度为1900mg/L，所述CaCl2·2H2O在所述共培养培养基中的浓度为440mg/L，所述MgSO4·7H2O在所述共培养培养基中的浓度为370mg/L，所述KH2PO4在所述共培养培养基中的浓度为170mg/L，所述FeSO4·7H2O在所述共培养培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na2在所述共培养培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在所述共培养培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl2·6H2O在所述共培养培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H3BO3在所述共培养培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H2O在所述共培养培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO4·4H2O在所述共培养培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO4·5H2O在所述共培养培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO4·7H2O在所述共培养培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在所述共培养培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在所述共培养培养基中的浓度为5mg/L，所述甘氨酸在所述共培养培养基中的浓度为2.0mg/L，所述硫胺素在所述共培养培养基中的浓度为0.1mg/L，所述盐酸吡哆辛在所述共培养培养基中的浓度为0.5mg/L，所述6‑苄氨基腺嘌呤在所述共培养培养基中的浓度为1.0mg/L，所述α‑萘乙酸在所述共培养培养基中的浓度为0.1mg/L，所述蔗糖在所述共培养培养基中的浓度为30g/L，所述琼脂在所述共培养培养基中的浓度为1.0g/L，所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基中的浓度为100μmol/L，所述共培养培养基的pH值为5.2；在所述共培养后，包括诱导筛选培养和生根培养的步骤；所述目的基因为Bt‑pinII基因和bar基因；所述Bt‑pinII基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述诱导筛选培养和所述生根培养的方法中培养条件均为：温度为25℃、光照周期为16h光照/8h黑暗、光强度为3000lx；所述诱导筛选培养基由NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O、EDTA·Na2、KI、CoCl2·6H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、MnSO4·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、肌醇、烟酸、甘氨酸、硫胺素、盐酸吡哆辛、6‑苄氨基腺嘌呤、α‑萘乙酸、蔗糖、琼脂、草胺膦、羧卞青霉素和水组成；所述NH4NO3在所述诱导筛选培养基中的浓度为1650mg/L，所述KNO3在所述诱导筛选培养基中的浓度为1900mg/L，所述CaCl2·2H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为440mg/L，所述MgSO4·7H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为370mg/L，所述KH2PO4在所述诱导筛选培养基中的浓度为170mg/L，所述FeSO4·7H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na2在所述诱导筛选培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl2·6H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H3BO3在所述诱导筛选培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO4·4H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO4·5H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO4·7H2O在所述诱导筛选培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在所述诱导筛选培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在所述诱导筛选培养基中的浓度为5mg/L，所述甘氨酸在所述诱导筛选培养基基中的浓度为2.0mg/L，所述硫胺素在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.1mg/L，所述盐酸吡哆辛在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.5mg/L，所述6‑苄氨基腺嘌呤在所述诱导筛选培养基中的浓度为1.0mg/L，所述α‑萘乙酸在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.1mg/L，所述蔗糖在所述诱导筛选培养基中的浓度为30g/L，所述琼脂在所述诱导筛选培养基中的浓度为1.0g/L，所述草胺膦在所述诱导筛选培养基中的浓度为3‑7mg/L，所述羧卞青霉素在所述诱导筛选培养基中的浓度为300mg/L，所述诱导筛选培养基的pH值为5.8；所述生根培养基由NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O、EDTA·Na2、KI、CoCl2·6H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、MnSO4·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、肌醇、烟酸、甘氨酸、硫胺素、盐酸吡哆辛、6‑苄氨基腺嘌呤、α‑萘乙酸、蔗糖、琼脂、草胺膦、头孢霉素和水组成；所述NH4NO3在生根培养基中的浓度为1650mg/L，所述KNO3在生根培养基中的浓度为1900mg/L，所述CaCl2·2H2O在生根培养基中的浓度为440mg/L，所述MgSO4·7H2O在生根培养基中的浓度为370mg/L，所述KH2PO4在生根培养基中的浓度为170mg/L，所述FeSO4·7H2O在生根培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na2在生根培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在生根培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl2·6H2O在生根培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H3BO3在生根培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H2O在生根培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO4·4H2O在生根培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO4·5H2O在生根培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO4·7H2O在生根培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在生根培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在生根培养基中的浓度为5mg/L，所述甘氨酸在生根培养基中的浓度为2.0mg/L，所述硫胺素在生根培养基中的浓度为0.1mg/L，盐酸吡哆辛在生根培养基中的浓度为0.5mg/L，所述6‑苄氨基腺嘌呤在生根培养基中的浓度为1.0mg/L，所述α‑萘乙酸在生根培养基中的浓度为0.1mg/L，所述蔗糖在生根培养基中的浓度为30g/L，所述琼脂在生根培养基中的浓度为1.0g/L，所述草胺膦在生根培养基中的浓度为3‑7mg/L，所述头孢霉素在生根培养基中的浓度为20‑25mg/L，所述生根培养基的pH值为5.8；在所述侵染前，包括如下预培养的步骤：将所述甘蓝的子叶置于预培养培养基中，在温度为25℃、16h光照/8h黑暗光周期和光强度为3000lx的条件下培养2d；所述预培养培养基中除不含有乙酰丁香酮外，其余组成成分及各成分在培养基中的浓度与所述共培养培养基相同。