利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用酶拆分法制备L-硒代蛋氨酸的方法，它包括下述步骤：1、将新鲜动物内脏加磷酸盐缓冲液打碎、分离，沉淀物离心沉降透析后用磷酸盐溶液稀释为氨基酰化酶备用；2、取NaOH和Na2CO3加水配成缓冲液，将DL-硒代蛋氨酸搅拌加入使之溶解，滴加乙酸酐调整为阴性，用浓HCl调溶液pH1-2，密封放置析出淡黄色结晶，抽滤、去离子水洗涤，用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品；3、将N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸用去离子水稀释，NaOH调节，加入CoCl2溶液和氨基酰化酶后用乙酸中和、活性炭脱色后，滤液蒸发至干，用乙酸乙酯提取得L-硒代蛋氨酸粗品，精制后即得L-硒代蛋氨酸精品。

主权项

一种利用酶拆分法制备L‑硒代蛋氨酸的方法，其特征在于：它包括下述步骤：第一步：氨基酰化酶的制备将新鲜动物内脏100重量份切除内膜洗净，加入pH7.0冷冻0‑5℃的磷酸盐缓冲溶液100重量份，置于捣碎机中打碎成细浆，再加入冷冻0‑5℃磷酸盐缓冲溶液150重量份，在0‑5℃下，搅拌浸取30‑40min，将浸取混合液置于冷冻离心机中，0‑5℃条件下离心分离30min后，取上清液在相同条件下再重复离心分离两次，取最后得到的上清液慢慢加入碾细的固体(NH4)2SO4至30‑50％饱和，在0‑5℃下搅拌使其均匀后，置于冰箱中0‑5℃放置过夜，将上清液虹吸倒出，剩余沉淀物置于冷冻离心机中，在温度0‑5℃条件下，离心沉降得盐析沉降物，将其装入透析袋并放入去离子水中，于0‑5℃透析12‑24h，用BaCl2检验透析液无SO42‑离子时，透析完毕；将透析后的酶液冷冻离心除去杂蛋白后，用pH7.0磷酸盐缓冲液稀释，在0‑‑4℃条件下保存于冰箱中备用；第二步：N‑乙酰‑DL‑硒代蛋氨酸的制备取NaOH和Na2CO3按照2∶5‑6重量份的比例添加到60份水中配成缓冲液，将20重量份的DL‑硒代蛋氨酸搅拌加入使之溶解，冷却到20℃以下，缓慢滴加乙酸酐14‑15重量份，继续搅拌2小时后，用茚三酮显色呈阴性即可；然后用浓HCl调溶液pH1‑2，密封后在小于5℃条件中放置20h析出淡黄色结晶，经抽滤、去离子水洗涤，再用乙醚洗至中性，干燥后既得N‑乙酰‑DL‑硒代蛋氨酸成品；第三步：L‑硒代蛋氨酸的制备a、拆分：取第二步中所得的N‑乙酰‑DL‑硒代蛋氨酸18‑20重量份，用去离子水400重量份稀释，用6mol/LNaOH调节pH7.0‑8.0，加入2重量份的0.1mol/LCoCl2溶液，再加入氨基酰化酶，酶用量为700U/mmol底物，在20‑40℃下，保温40‑110h，然后用乙酸中和至pH5‑6，加入活性炭脱色，于80‑85℃加热搅拌后，过滤除去活性炭，将滤液减压蒸发至干，得N‑乙酰‑D‑硒代蛋氨酸与L‑硒代蛋氨酸的混合物，用乙酸乙酯提取三次，合并提取液待用，剩余物为L‑硒代蛋氨酸粗品；b、精制：将上述所得L‑硒代蛋氨酸粗品溶于80‑90℃热水中，用HCl调pH5.5‑6.0，加入1‑4g/L活性炭处理，热滤，滤液冷却至室温，再滴加乙醇至出现白色混浊为止，于0‑6℃放置数小时结晶，抽滤，即得精制的L‑硒代蛋氨酸精品。