核酸杂交分子的洗脱分选方法

摘要

核酸杂交分子的洗脱分选方法，涉及一种核酸片段的分选方法，特别是涉及一种主要用于分离重复次数不同的微卫星DNA片段的分选方法。提供一种可提高目的核酸片段的特异性、估算杂交分子的熔点、分选匹配程度不同的核酸片段，兼顾产量和特异性的核酸杂交分子的洗脱分选方法。将包含特征序列核酸捕获探针和待分选的核酸片段杂交，并固定在固相基质上，用洗脱液漂洗以获得产物。逐渐提高洗脱液的洗脱强度，便获得特异性越来越高的产物。分析不同洗脱强度下产物的特异性，以便分别收集特异性不同的产物，实现对同类核酸片段的分选。

主权项

核酸杂交分子的洗脱分选方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据所需要的核酸片段的类型确定核酸片段的特征序列，合成核酸捕获探针；2)将核酸捕获探针与待分选的核酸片段退火形成杂交分子，然后固定在固相基质上，或者先把核酸捕获探针固定在固相基质上，然后再与待分选的核酸片段退火形成杂交分子；3)先用低洗脱强度的洗脱液漂洗杂交分子，以获取与探针匹配程度较低的核酸片段，之后逐渐提高洗脱强度，以获取与探针匹配程度较高的核酸片段，所述低洗脱强度的洗脱液为室温下的6×SSC，所述逐渐提高洗脱强度的最高洗脱强度的洗脱液为98℃下的超纯水；所述高洗脱强度的离子强度低于低洗脱强度的离子强度，或者高洗脱强度的温度高于低洗脱强度的温度，或者高洗脱强度的pH值高于低洗脱强度的pH值；4)从最低洗脱强度开始，将步骤3)的一系列梯度的洗脱液依次漂洗固相基质，回收每一步的洗脱液；5)检测每一步的回收洗脱液的核酸片段产量，排除无产物的回收液，在有产物的一系列回收液中，最高洗脱强度设为上临界洗脱强度；若对核酸片段特异性要求很高，则只收集上临界洗脱强度下的回收产物，即与探针最匹配的特异性核酸片段，完成核酸杂交分子的洗脱分选；所述核酸片段特异性要求很高是指核酸片段与核酸探针的匹配程度为80％～100％；若对核酸片段特异性要求不是很高，则继续以下步骤；所述核酸片段特异性要求不是很高是指核酸片段与核酸探针的匹配程度小于80％；6)将每个梯度的回收产物分别构建文库，通过菌落PCR、菌落载体测序或菌落杂交的方法分析各个洗脱梯度的产物与探针的匹配程度，估算杂交分子的熔点，了解洗脱不同匹配程度的核酸片段所需要的不同洗脱强度；7)确定因特异性太低而无法适用的核酸片段的范围，以及所对应的洗脱强度的范围，该洗脱强度的上界设为下临界洗脱强度；8)从下临界洗脱强度到上临界洗脱强度重新设置一系列洗脱强度梯度的洗脱液，其中低于下临界洗脱强度的梯度合并，高于上临界洗脱强度的梯度合并，若需要根据核酸片段与核酸探针匹配程度的高低对核酸片段进行分别回收，则下临界洗脱强度与上临界洗脱强度之间需要设置密集的梯度；否则，合并下临界洗脱强度与上临界洗脱强度之间的梯度；9)将包含特定序列的捕获探针与待分选的核酸片段杂交，然后将杂交分子固定在固相基质上；或者先将捕获探针固定在固相基质上，然后将待分选的核酸片段杂交在捕获探针上，然后从下临界洗脱强度开始，将步骤8)的一系列梯度的洗脱液依次漂洗固相基质，回收每一步的洗脱液；10)根据步骤6)的结果得知各个洗脱梯度的产物的特异性，分别收集不同梯度下的洗脱产物，达到对同类核酸片段的分级分选，应用于不同的实验需求，即完成核酸杂交分子的洗脱分选。