用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液及其制备方法和使用方法

摘要

本发明涉及一种用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液及其制备方法和使用方法。机体对外周组织缺血的保护性反应相对复杂，单一生长因子干预虽有效但无法完成这一过程；干、祖细胞移植虽能改善缺血组织的血管密度和血流灌注，但主要细胞来源骨髓、脐带血等的获取存在严重局限，而且细胞的在体生存能力极为有限，严重影响其治疗作用的发挥。本发明利用人碱性成纤维细胞生长因子干预脂肪间充质基质细胞，并联合血管内皮细胞生长因子共同作用，促进缺血组织血管生成。本发明克服了单一因子或细胞治疗的获益局限，保证了干细胞的足量获取，并提高了移植细胞的存活能力和血管生成效应，从而能进一步改善缺血下肢的血流灌注，提高肢体存活率。

主权项

1.用于促进缺血组织血管生成的干细胞联合生长因子注射液的制备方法，其特征在于：由以下步骤实现：步骤一：将取材于8-10周龄-actin-luc转基因FVB小鼠腹股沟、腹膜腔和肾周的脂肪组织剪碎，用含有青/链霉素各100U/mL的无菌磷酸盐缓冲液清洗3次后，加入含0.2%Ⅰ型胶原酶的Dulbecco改良Eagle/F12培养基，轻微振摇下37℃水浴消化60-75min；步骤二：等体积的Dulbecco改良Eagle/F12完全培养基终止消化，Dulbecco改良Eagle/F12完全培养基中含有体积分数为10%的胎牛血清和青/链霉素各100U/mL；步骤三：将细胞悬液在室温下200×g离心10min，分离出脂肪组织中基质血管部分，然后在Dulbecco改良Eagle/F12完全培养基中重悬脂肪组织中基质血管部分，以37℃、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度培养48-72h后，去除未贴壁细胞；步骤四：贴壁细胞经消化、计数后，以2×10⁴/cm²密度接种于25cm²培养瓶中，即为原代脂肪间充质基质细胞；将细胞进行体外扩增时，在完全培养基中按2ng/ml的浓度加入人碱性成纤维细胞生长因子；步骤五：细胞生长至培养面积的80%后，采用0.05%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化传代；收集第3代脂肪间充质基质细胞，在Dulbecco改良Eagle/F12完全培养基中重悬，接种到75cm²细胞培养瓶中；然后以10ng/mL的浓度加入血管内皮细胞生长因子，预处理脂肪间充质基质细胞24小时；步骤六：取1.0×10⁶数量、血管内皮细胞生长因子预处理24小时后的脂肪间充质基质细胞，与10.0ng血管内皮细胞生长因子混合，得到目的产物。