发明名称 重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法
摘要 本发明公开了一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法,该方法以蛔虫成虫虫体或者感染性虫卵的RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ALAg基因,构建ALAg表达载体并转化表达菌进行诱导表达,纯化重组蛋白,以纯化蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法。本发明建立了稳定而特异的抗蛔虫体IgG的间接ELISA检测方法,可用于蛔虫感染的临床监测和诊断,适宜在基层和临床广泛推广。
申请公布号 CN102279271A 申请公布日期 2011.12.14
申请号 CN201110178619.8 申请日期 2011.06.29
申请人 贵阳中医学院 发明人 何光志;田维毅;安传伟;王平;黄高;王文佳;俞琦;奚锦;王乾宇
分类号 G01N33/68(2006.01)I;G01N33/531(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C07K14/435(2006.01)I 主分类号 G01N33/68(2006.01)I
代理机构 北京联创佳为专利事务所(普通合伙) 11362 代理人 张浩宇
主权项 一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法,其特征在于,按照下列步骤进行:(1)重组蛔虫ALAg蛋白抗原的制备①蛔虫成虫总RNA的提取和RT从‑70℃冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵,置于研钵中磨成粉末,然后按RNA提取试剂盒说明提取总RNA,以抽提的总RNA为模板,反转录为cDNA;②ALAg基因的扩增和克隆以cDNA为模板,根据Genbank中公布的猪蛔虫抗原基因的序列,利用PrimerPrimer 5.0软件设计引物进行扩增蛔虫的ALAg基因,所述引物中,上游引物为:5’‑CGCGGATCC GCCAGTTTAAGCGAGATGC‑3′(含BamHI酶切位点);下游引物为:5’‑CCGGAATTCGAGAAGCTTATGCCTCGCTT‑3′(含EcoR I酶切位点);扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收ALAg目的片段;将ALAg与pMD18‑T载体连接,然后转化感受态细胞DH5α,涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养,挑取菌落进行经过菌落PCR鉴定后,抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒pMD18‑T‑ALAg进行测序;③Pet28a(+)‑ALAg重组质粒构建及酶切鉴定将测序正确的阳性菌,提取质粒pMD18‑T‑ALAg,分别采用BamH I和EcoR I进行酶切pMD18‑T‑ALAg质粒和Pet28a(+)表达载体,纯化目的片段进行连接成Pet28a(+)‑ALAg,并转入DH5α中,涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养,挑取菌落进行经过菌落PCR和酶切鉴定后,抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒Pet28a(+)‑ALAg进行测序;④重组Pet28a(+)‑ALAg质粒在大肠杆菌中的诱导表达将测序正确的阳性质粒Pet28a(+)‑ALAg转化BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG进行诱导表达;⑤重组ALAg蛋白的纯化按1∶100比例将培养过夜的含有Pet 28a(+)‑ALAg的BL21(DE3)接种到新的LB液体培养基中,37℃快速振荡培养至细菌生长对数中期,A550=1.0;在IPTG诱导下,进行重组ALAg蛋白的大量表达,收集诱导表达菌;离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后,依次用含0、2、4mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液洗涤沉淀;随后用含8mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液重悬沉淀,冰上放置1h,使包涵体蛋白完全溶解;16,000×g离心30min去除不可溶物,以孔径0.45mm的NC膜过滤收集上清液;经His结合树脂纯化,以缓冲液洗去杂蛋白,以洗脱液洗脱重组ALAg蛋白;将纯化的重组蛋白于4℃分别在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次进行透析,将溶液进行冷冻干燥后于4℃保存;(2)以纯化后的重组ALAg蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法①最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定将重组ALAg蛋白用pH为9.6的0.05M的碳酸盐稀释成为25、10、5、1、0.5、0.1μg/mL 6个浓度包被酶联板100μL/孔,每个浓度包被1列,于37℃温浴1h后放置于4℃过夜,取出用含0.05%Tween‑20的PBS‑T洗涤3次,每次3min,然后每孔再加1%牛血清白蛋白(BSA)100μL封闭液,37℃封闭30min;然后将已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上从1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和1∶320倍比稀释,分别加入酶标板中,100μL/孔,37℃反应1h后,洗涤3次,用封闭液作1∶8000稀释辣根过氧化物酶标鼠抗人IgG加入酶联板,100μL/孔,37℃反应1h,经洗涤后加入TMB底物溶液100μL/孔,反应15min,最后加入100μL2mol/L硫酸终止反应,用酶标仪在490nm波长下测定OD值,同时用健康人血清作方阵滴定;选择已知蛔虫阳性血清与蛔虫阴性血清OD490的P/N比值最大所对应的抗原、抗体稀释度作为判定标准;②鼠抗人IgG‑HRP的最佳工作浓度的确定将鼠抗人IgG‑HRP作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍比稀释,通过检测已知阳性和阴性血清,来确定鼠抗人IgG‑HRP的最佳工作浓度;③间接ELISA方法建立将重组ALAg蛋白以最佳包被浓度包被酶标板100μL/孔,于37℃过夜,洗涤3次,每次3min,晾干;加入100μL/孔封闭液,37℃温浴1h,然后将待检血清按步骤(2)的步骤①中试验结果得出的最佳稀释倍数稀释后加入酶标板100μL/孔,37℃温浴1h,洗涤3次,晾干,加入步骤(2)的步骤②试验结果得出的最佳工作浓度的鼠抗人IgG‑HRP 100μL/孔,37℃温浴1h,洗涤3次,每次3min,晾干,加入TMB底物100μL/孔,37℃反应15min,最后加入100μL12mol/L硫酸终止反应,用酶标仪测OD490值。
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