一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法

摘要

本发明是一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法，其是对现有SDS-PAGE技术的改进，本发明的方法由大豆Lox脂氧酶蛋白的提取、聚丙烯酰胺凝胶的制备、SDS-PAGE电泳，胶的染色及脱色五部分构成，其中Lox脂氧酶的提取、聚丙烯酰胺凝胶的制备是本发明的核心所在，SDS-PAGE电泳胶的染色和脱色为常规共有技术。本发明的方法克服了原有技术不能直观区分Lox-1，-2，-3中，单一缺失或双缺失的缺陷，提供了一种可用于Lox-1和Lox-2缺失的鉴定，且操作简单、快速，鉴定结果直观准确的方法。

主权项

一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)大豆Lox脂氧酶蛋白的提取：切取种子细粉6～8mg，放入1.5mL的离心管中，加入提取缓冲液，用震荡器搅拌均匀，超声波萃取6～8min，室温下放置20～30min，再度搅拌后，5000r·min‑1离心5min，取上清液10μL‑12μL用于SDS‑PAGE电泳解析；(2)聚丙烯酰胺凝胶的制备：成胶溶液的配制：A液：配制成由4.0g/L SDS，3M Tris‑HCl组成的混合溶液，pH值调至8.8；B液：配制成0.48M HCl溶液，用Tris调整PH至7.0；C液：配制成由300g/L的丙烯酰胺，8g/L的双丙烯酰胺组成的混合溶液；P液：配制成15g/L的过硫酸铵溶液；E液：配制成0.04g/L的核黄素溶液；分离胶的配制：配制质量体积百分比为6.75％的聚丙烯酰胺凝胶液，以规格为16cm×14cm的玻璃板制取1mm厚的胶2枚为例，需分离胶溶液36mL，由以下体积的溶液组成：A液9.0mL、C液8.1mL、P液1.8mL、蒸馏水17.1mL、N，N，N′，N′‑四甲基乙二胺24μL；浓缩胶配制：以配制上述规格的胶为例，两块板需浓缩胶溶液12mL，由以下体积的溶液组成：B液3.2mL，C液2.0mL，E液2.6mL，P液0.4mL，蒸馏水3.8mL、N，N，N′，N′‑四甲基乙二胺12μL；(3)SDS‑PAGE电泳：电泳缓冲液的配制：配制成甘氨酸14.4g/L，Tris 3.0g/L，SDS 1.25g/L的混合溶液，备用；(4)胶的染色及脱色。