一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法

摘要

本发明公开了一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，该方法首次将玻璃化法超低温保存技术应用于苦荞麦愈伤组织的保存，并提供了的一种新型玻璃化保护剂(按每升计)：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2-丙二醇溶液100mL，同时在洗涤方式做了改进，将三步梯度洗脱首次运用到了植物的玻璃化法超低温保存上，所采用的三步梯度洗涤液依次为(按每升计)：牛血清蛋白30g+蔗糖1.0mol+山梨醇0.5mol、牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol+山梨醇1.0mol、牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol。本发明能使超低温保存材料的存活率得到显著地提高，最高可达90.02％。

主权项

一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，其特征在于包括如下步骤：(1)预培养：取苦荞麦的愈伤组织，置于装有培养液的冷冻管中，在常温下预培养1天，所述培养液按每升计含：二甲基亚砜50mL+山梨醇0.4mol；(2)装载：取预培养1天后的愈伤组织置于装有装载液的冷冻管中，在4℃装载处理20～60分钟，所述装载液由浓度为0.5mol/L的蔗糖溶液与玻璃化溶液按体积比40∶60配制而成，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2 丙二醇溶液100mL；(3)脱水：取装载后的愈伤组织置于装有玻璃化溶液的冷冻管中，在0℃脱水处理40～80分钟，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2 丙二醇溶液100mL；(4)冷冻保存：将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存；(5)解冻及洗涤：当需要使用愈伤组织时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入30～50℃的水浴中进行解冻处理，解冻完成后迅速去掉玻璃化溶液，并采用三步梯度洗涤法进行洗涤，首先采用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖1.0mol+山梨醇0.5mol的洗涤液洗涤10分钟，再用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol+山梨醇1.0mol的洗涤液洗涤10分钟，最后使用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol的洗涤液洗涤10分钟。