葎草花粉主要致敏蛋白单克隆抗体

摘要

本发明提供了葎草花粉主要致敏蛋白单克隆抗体，其是以葎草花粉主要致敏蛋白作为免疫原制备获得。所述葎草花粉主要致敏蛋白可从葎草花粉中分离获得，能与89％以上葎草花粉过敏病人血清特异性IgE结合，经SDS-PAGE测定其表观分子量约为12kDa，等电点为4.7，N端序列为：NH4+-MDNPFENGMKA-COO-。其可用于葎草花粉变应原制剂中主要致敏蛋白的定量标示。

主权项

1.葎草花粉主要致敏蛋白单克隆抗体，其是以葎草花粉主要致敏蛋白为免疫原制备获得，所述葎草花粉主要致敏蛋白经SDS-PAGE测定表观分子量为12kDa，等电点为4.7，N端序列为：NH₄⁺-MDNPFENGMKA-COO^-，所述主要致敏蛋白通过如下方法制备获得：(一)凝胶分子排阻层析层析系统：Purifier10层析柱：Sephacryl 100 预装柱柱体积 120ml长度×直径：60cm×16mm分离范围：10-100kDa1)样品制备：a、将新鲜采集的葎草花粉用丙酮脱脂，干燥；b、4℃条件下用pH8.0的0.01M PBS磁力温和搅拌提取24小时；c、4℃下10000g×30min进行离心得到上清液；d、将上清液浓缩至蛋白浓度至少1mg/ml时进行80％饱和度的硫酸铵盐析沉淀，5000g×30min离心处理，弃去上清后将沉淀蛋白复溶于pH8.0的0.01M PBS缓冲液中，并用该缓冲液在4℃进行2d的透析处理以去掉其中的硫酸铵，后浓缩使蛋白浓度达到12mg/ml；2)平衡液和洗脱液：0.05M PBS，pH7.2洗脱条件：V上样量＝1ml，流速0.5ml/min目标组分是平均保留体积为87.25±0.65ml的洗脱峰，该组分包含了10～38kDa范围的蛋白；(二)阴离子交换层析层析系统：Purifier10层析柱：HiTrap Q FF，CV＝1ml，缓冲系统：缓冲液A：0.02M BisTris-HCl，pH7.0分离过程：将凝胶分子排阻色谱分离得到的目标组分收集液经蒸馏水透析并浓缩处理后用缓冲液A作5～10倍稀释以调整该蛋白溶液的pH值达到7.0，经10000g×10min离心后将上清液加入到用缓冲液A平衡好的阴离子交换柱HiTrap Q FF中，用含0～0.1M NaCl浓度梯度的缓冲液A进行线性梯度洗脱15ml，再以0.1M NaCl浓度恒定洗脱15ml，接着用含0.1～0.2M NaCl浓度梯度的缓冲液A进行20ml的线性梯度洗脱，其中流速设定为1ml/min；分离结果：在0～0.1M NaCl浓度范围的线性梯度洗脱阶段及随后的0.1MNaCl恒定浓度洗脱阶段先后出了三个峰，这三个峰都未达到基线分离，1为主峰，2、3为连续的两个小肩峰，在0.1～0.2M NaCl浓度范围的线性梯度洗脱阶段出了一个不尖锐的单峰，该峰为主要致敏蛋白的洗脱峰。