一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法

摘要

一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法，是从水牛胎儿分离培养得到水牛胎儿成纤维(BFF)，再将携带新霉素抗性基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的转基因载体(pCE-EGFP-IRES-neo)通过电穿孔法导入BFF，并通过G418筛选获得转EGFP基因的BFF；而后，将转EGFP基因的BFF移植到去核的水牛卵母细胞构建克隆重构胚，经5μmol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理后，置于颗粒细胞单层共培养6-7d后获得转基因克隆囊胚。在倒置荧光显微镜下挑选表达EGFP的转基因克隆囊胚移植到受体水牛，经过妊娠足月后分娩获得转基因克隆犊牛。经紫外灯照射，这些转基因克隆水牛犊头部和四肢明显均表达EGFP标记基因，证明用本发明的方法可成功生产转基因克隆水牛。

主权项

一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)水牛胎儿成纤维细胞的转染与筛选：传代培养至三代的水牛胎儿成纤维细胞使用线性质粒DNA(pCE‑EGFP‑IRES‑neo)采用电穿孔法进行转染，然后用DMEM+10％胎牛血清+600μg/ml G418的培养液筛选培养6～10d后，挑取细胞数超过60个的细胞集落扩大培养，获得G418抗性的转EGFP基因细胞，(2)转基因克隆水牛的生产：水牛卵母细胞在体外成熟培养22h后，选择有第一极体的卵母细胞于装有Spindle‑view系统的倒置显微镜下进行去核获得受体卵母细胞，供体细胞为转染筛选后且通过接触抑制法培养的水牛胎儿成纤维细胞，经倒置荧光显微镜观察确证表达EGFP后注入到去核的卵母细胞卵周隙中，然后采用安装在显微操作仪上可活动的距离为0.2mm的两根铂金丝微电极针进行电融合，融合后的核移植重构胚用离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6‑二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理，然后置于含颗粒细胞单层的微滴中共培养6～7d，将获得的克隆囊胚在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况，筛选出表达EGFP的转基因克隆囊胚移植到受体母水牛的子宫角中，受体水牛经妊娠足月后产下犊牛，在紫外灯照射下，这些转基因克隆水牛犊头部和四肢明显均表达有EGFP标记基因。