一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法

摘要

本发明公开了一种从高效表达的基因工程菌中提取重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法。该菌是携带重组质粒的大肠杆菌Rosetta(DE3)，该重组质粒是含黄曲霉尿酸氧化酶uricase基因的质粒pET-30c(+)。用该菌生产黄曲霉尿酸氧化酶的方法包括四个步骤：A、工程菌发酵，累积胞内尿酸氧化酶；B、超声波破胞，离心收集上清液（含可溶性尿酸氧化酶）；C、依次进行离子交换层析、疏水层析及凝胶过滤层析，收集活性峰；D、将活性峰冷冻干燥，即得高纯度的重组黄曲霉尿酸氧化酶。本发明的优点：生产重组黄曲霉尿酸氧化酶成本低，酶的表达量高，纯化步骤简便，收率大，纯度高，易于工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

主权项

一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其步骤是：a.Uricase DNA序列的扩增：合成碱基序列：P5 5’端引物，引入NdeI酶切位点，P3 3’端引物，引入XhoI酶切位点，P5：5’ GGAATTCCATATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACG 3’NdeI；P3：5’ AGCCTCGAGTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGACCG 3’XhoI；以黄曲霉菌丝体总RNA为模板，按RT PCR试剂盒的操作，进行RT PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得Uricase DNA片段，将扩增产物与T克隆载体pMD18 T连接，得到含Uricase DNA片段的重组质粒pMD 18 uricase；b.构建含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列的基因工程菌：用两种限制性内切酶双酶切步骤a获得的重组质粒，所述的两种限制性内切酶是NdeI和XhoI，纯化回收小片段，用同样的两种限制性内切酶双酶切质粒pET 30c(+)，纯化回收大片段，连接回收的小片段和大片段，得到含Uricase DNA片段的重组质粒pET 30c uricase，将此重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，制得含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列，即Uricase DNA序列的基因工程菌；c.构建高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌：从步骤b构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET 30c uricase，转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌；d.液体培养：将步骤c构建好的表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4 1.2时，加入终浓度为0.2 1.0mM的IPTG进行诱导表达2 6小时，生产和积累可溶性表达的黄曲霉尿酸氧化酶；e.细胞破碎：用冷冻离心机将步骤d获得的发酵液于4 20℃下以1000 10000g的速度离心5 30min，弃上清，用20 150mL裂解缓冲液：20mMNa2CO3/NaHCO3，2mM EDTA，pH 10.0，悬浮1L发酵液所培养的菌体，将装有20 200mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波功率300 500W，工作时间3 8秒，间隔时间3 10秒，共工作90 150次，4 10℃下1000 18000rpm离心30 60)min，收集上清液于4 20℃下保存备用；f.离子交换层析：将步骤e所获得的细胞破碎液进行阴离子柱层析，层析柱用裂解缓冲液：20mM Na2CO3/NaHCO3，2mM EDTA，pH 10.0，平衡好，将上述裂解液样品过此柱，用此裂解液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以其为流动相加0.1、0.2MNaCl，以2 4倍柱体积进行分步洗脱，收集由0.2MNaCl的洗脱峰，此峰即为纯化和浓缩的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液；g.疏水层析：将步骤f所得纯化浓缩的组黄曲霉尿酸氧化酶溶液进行疏水层析，层析柱预先用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液：pH 7.2，20mM，平衡好备用，将阴离子交换层析得到的活性大肠杆菌表达的黄曲霉尿酸氧化酶组分用磷酸盐缓冲液：pH 7.2，20mM，透析，透析液加入硫酸铵至终浓度0.8M，上样，用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，以分别含有0.6、0.4、0.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液，以2 4倍柱体积进行分步洗脱，收集0.2M硫酸铵的洗脱峰，将该峰洗脱液用截留分子量为10,000的超滤膜进行超滤浓缩；h.凝胶过滤层析：将步骤g所得浓缩液经凝胶过滤层析，用平衡液：pH 7.2，20mM的磷酸盐缓冲液，平衡，待样品进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，洗脱特征峰 主峰即为所需的纯重组黄曲霉尿酸氧化酶；i.冷冻干燥：将凝胶过滤分离后的收集液于 30℃ 50℃下冷冻升华干燥，每升发酵液制得150 300mg纯度大于99％的白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶。