CD19单克隆抗体免疫脂质体的制备及用途

摘要

本发明提供一种CD19单克隆抗体去甲斑蝥素免疫脂质体，首先采用薄膜分散法，制备立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体，其中大豆卵磷脂、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺按起始摩尔比为2∶1∶0.01，去甲斑蝥素免疫脂质体与大豆卵磷脂的质量比为1∶20，高效液相检测NCTD的包封率达(46.5±2.21)％。研究证实，2E8-SL-PE能特异性地与Nalm-6和Raji细胞结合，阳性率分别为89.44％和88.73％，而几乎不与Molt-3和K562细胞结合，后两者的阳性率分别仅为1.95％和1.39％，说明该免疫脂质体具有明显的靶向识别作用。可在制备特异性靶向杀伤B淋巴细胞白血病及其干细胞药物中的应用。

主权项

一种CD19单克隆抗体免疫脂质体，通过以下步骤制备：(1)CD19单克隆抗体ZCH‑4‑2E8的制备：基本按Koller&Milstein报告的鼠‑鼠杂交瘤经典方法制备，所述单抗重链可变区基因编码的氨基酸如SEQ ID NO 3所示，所述单抗轻链可变区基因编码的氨基酸如SEQ ID NO 4所示；(2)2E8修饰的立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体2E8‑SL‑NCTD的制备：首先采用薄膜分散法，制备立体空间稳定性去甲斑蝥素脂质体，将大豆卵磷脂、胆固醇，甲氧基‑聚乙二醇2000‑磷脂酰乙醇胺按2∶1∶0.01的摩尔比溶于氯仿中，减压旋转蒸发去除有机溶剂，然后在含有去甲斑蝥素脂质体的HBS缓冲液中水化，形成脂质体混悬液，此脂质体混悬液通过孔径为1.2，0.4，0.1微米的聚碳酸脂膜整粒10次，分别取NCTD，空白脂质体和NCTD脂质体混悬液1ml，过SephadexG‑50，流速1ml/min，每分钟收集一份洗脱液，共收集25份，分光光度法测量NCTD在213nm处的吸光值，以吸光值对洗脱体积作流出曲线；(3)胶束准备：取甲氧基‑聚乙二醇2000‑磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺‑聚乙二醇2000‑二硬脂酸磷脂酰乙醇胺，按4∶1摩尔比溶于氯仿中，减压旋转蒸发去除有机溶剂并真空过夜干燥，而后在HBS缓冲液中水化1小时；(4)2E8与胶束连接：取10mg/ml 2E8单抗与2‑亚氨基硫烷盐酸盐试剂按1∶50摩尔比反应，通过Sephadex G‑50，以HBS缓冲液为洗脱液去除未反应的2‑亚氨基硫烷盐酸盐试剂，然后，以浓度180ug 2E8/umol PC与步骤(3)胶束在HBS缓冲液中，4℃孵育反应过夜；(5)2E8单抗从胶束转移至脂质体：将所获得的抗体与胶束的混悬液通过0.22um的微孔滤膜以去除未连接单抗的胶束和自身发生聚集的胶束，过滤后的悬液与先前制备的SL‑NCTD，按磷脂摩尔比0.05∶1，60℃敷育1小时，待其冷却后，过Sepharose CL‑4B色谱柱，以HBS缓冲液平衡并洗脱柱子，去除未转移的2E8单抗，Sepharose CL‑4B湿装柱的直径1.5cm，柱床体积44ml，分别取0.5ml游离2E8与0.5ml SL‑NCTD，经Sepharose CL‑4B，以HBS缓冲液洗脱，流速1ml/min，每2ml收集一份洗脱液，在213nm处收集获得目的物。