体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法

摘要

一种基于细胞培养和串级质谱的蛋白质组学相对定量方法。在细胞培养过程中加入相同质量增加的重同位素标记的精氨酸或赖氨酸，细胞蛋白提取液按不同比例混合，经过特异性内切酶Lys-N和Arg-C酶解后，直接2D-LC-MS/MS分析，提取串级质谱中具有固定质量增加的b,y碎片离子对的峰强度，做比值后确定相应肽段和蛋白的相对量，该方法克服了一级质谱定量的复杂度增加的问题和同重同位素标签串级质谱定量的低质量端抑制效应，提高了一级质谱信号的灵敏度，同时由于在串级质谱中采用多对b,y碎片离子对进行定量，从而保证了该定量方法的准确性和可靠性。为定量蛋白质组学的研究和发展，提供了一个新的方法和技术平台。

主权项

一种体内终端氨基酸标记的定量蛋白质组学方法，其特征在于具体步骤：A、培养基的配制：（a）、在缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM细胞培养基中加入重同位素标记的精氨酸、正常的赖氨酸、透析牛胎血清、青霉素、链霉素和脯氨酸；（b）、在另一缺乏精氨酸和赖氨酸的 DMEM 细胞培养基中加入重同位素标记的赖氨酸、正常的精氨酸、透析牛胎血清、青霉素、链霉素和脯氨酸；其中，重同位素标记的精氨酸与正常的精氨酸相比，分子质量有所增加，重同位素标记的赖氨酸与正常的赖氨酸相比，分子质量也有所增加，并且二者增加的分子质量相等，重同位素标记的赖氨酸称为重赖氨酸，重同位素标记的精氨酸称为重精氨酸；B、细胞培养：分别使用上述两种培养基，培养细胞；C、全蛋白提取：收集传代6代以上的细胞，分别从重赖氨酸标记的细胞和重精氨酸标记的细胞中提取全蛋白；D、不同比例全蛋白提取物的混合：分别将从重赖氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白和从重精氨酸标记的细胞中提取出的全蛋白按照不同质量比进行混合，所述质量比的范围为1:10‑10:1；E、蛋白混合物前处理：在碳酸氢铵水溶液中，溶解不同质量比的蛋白混合物，依次加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原烷基化，然后加入特异性内切酶Lys‑N和Arg‑C进行酶解，反应结束后冻干，将冻干粉重新溶解于体积比为20‑25%乙腈、75‑80% 10‑20mM磷酸二氢钾溶液，留待分析；F、蛋白混合物的检测：将上述得到的冻干粉重溶液注入强阳离子交换液相色谱进行分离，按峰形收集组分，将每个组分分别冻干后再重新溶解于体积比为0.05‑0.1%甲酸的纯水溶液中，将所得到的各组分重溶液通过反相液相色谱与质谱LTQ‑Orbitrap联用进行检测，提取串级质谱中具有固定质量增加的b, y碎片离子对的峰强度，做比值后确定相应肽段和蛋白的相对量。