大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备及其使用方法

摘要

本发明公开了一种大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备及其使用方法，所述疫苗是按下述方法制得，1.无菌获取濒死的含有蛙虹彩病毒的大鲵肝脏，制成组织匀浆；2.在冰面上将组织匀浆20kHz超声快速裂解，过滤；3.对滤液离心分离，得纯粹的病毒沉淀，然后调整病毒滴度达到105TCID50；4.病毒细胞培养，收获细胞培养液；5.用终浓度为0.4％的甲醛，将细胞培养液在37℃灭活5-10小时，即成为大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗。该疫苗4℃保存，一年内有效。幼鲵及0.25kg以下的成鲵免疫采用疫苗稀释液浸浴方式；0.25kg以上的成鲵免疫采取肌肉注射。该疫苗的免疫特异性很强，免疫率可达80-93％。

主权项

一种中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备方法，其特征是按下述步骤完成：(1)病鲵组织获取无菌获取濒死的并确诊其肝脏中含有蛙虹彩病毒的大鲵肝脏，将肝脏制成组织匀浆；(2)组织裂解病毒原液获取将组织匀浆在冰面上20kHz超声快速裂解，经过5000rpm离心30min，获取清液，然后用0.4um无菌过滤器过滤，得到滤液；(3)病毒的纯化将上述滤液经过20000rpm离心60min，去掉上清液，沉淀物用适量的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，再经20000rpm离心60min，获取的沉淀即为纯粹的病毒沉淀，然后调整病毒滴度达到105TCID50；(4)病毒细胞培养在无菌超净台上接种草鱼性腺细胞，或鲤鱼表皮瘤细胞，或293‑T细胞，在25℃、5％CO2培养箱中，用含有10％小牛血清的M199培养基，pH为7.0‑7.4，培养48‑72h，收获细胞培养液；(5)回归感染试验取少量上述细胞培养液，加入10倍量0.7％的生理盐水，制成病毒液，按大鲵体重0.1ml/kg的剂量给健康大鲵腹腔注射该病毒液，待被注射的大鲵发病后，即表现出“大脚病”的症状后，再次诊断检测，当确定为中国大鲵虹彩病毒感染后，再将此病毒液按上述步骤4扩大生产细胞培养液；(6)灭活、分装用终浓度为0.4％的甲醛，将细胞培养液在37℃灭活5‑10小时，即成为中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗。