一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激酶的方法

摘要

本发明涉及一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激酶的方法，涉及治疗血栓病的纳豆激酶的分离提取技术领域。主要有如下步骤：(1)纳豆激酶的液体深层发酵；(2)发酵除菌液的盐析、脱色处理；(3)亲和层析介质的制备；(4)亲和层析，即得纳豆激酶。本发明选用处理的大豆颗粒直接作为层析介质，代替了亲和层析常用的昂贵的琼脂糖、纤维素等材料，收率可达80％以上，具有简单独特、收率高、成本低、可以进行规模化生产的特点，具有较好的经济效益和社会效益。

主权项

一种利用大豆颗粒做亲和介质分离纯化纳豆激酶的方法，特征在于具有如下步骤：(1)准备或制取纳豆激酶发酵液；(2)准备或制备亲和层析介质，包括以下步骤：a、将大豆冲洗干净，用水充分浸泡膨胀；b、将之蒸熟；c、在研钵内加入无菌水，将熟大豆捣碎；d、用无菌水冲洗截取，得到大豆颗粒；e、将大豆颗粒用盐酸、水、NaOH、水、NaCl、水清洗顺序处理，在2～5℃低温保存备用；制备亲和层析介质时，操作方法为：在研钵内加入熟大豆重量1/10的无菌水，将步骤b的熟大豆捣碎，用无菌水冲洗过20目筛，再用60目筛截取，得到大豆颗粒；将大豆颗粒用1mol/L的盐酸、水、1mol/L的NaOH、水、1mol/L的NaCl、水顺序清洗处理后，在2～5℃低温保存；(3)利用上述的大豆颗粒进行亲和层析，操作方法为：a.将处理好的大豆颗粒作为层析介质装入层析柱，在室温下，用pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液平衡，利用紫外蛋白检测仪进行色谱在线监测，流速为0.2～0.8ml/min；b.待基线平稳在后，用蠕动泵加入纳豆激酶发酵除菌液即粗酶液5ml，上样完毕后，继续用pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液平衡淋洗，出现杂蛋白淋洗峰，收集杂蛋白峰，采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活力；c.待杂蛋白峰过后，回到基线，换用NaCl溶液用pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液配制的0～1mol/L的NaCl溶液线性梯度洗脱，在达到0.4mol/L的NaCl溶液时出现洗脱峰，收集洗脱峰，采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活力；对pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液透析，冷冻干燥后得到纯化后的纳豆激酶，采用纤维蛋白平板法测定酶活力。