一种基于免疫磁珠富集的甲型流感病毒检测试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种基于免疫磁珠富集的甲型流感病毒检测试剂盒及方法，试剂盒包括A、免疫富集反应体系组分；B、环介导的等温核酸扩增体系组分；C、抗体的制备；D、免疫磁珠的制备；E、设计甲型H1N1流感病毒的特异性引物，用于环介导的等温65ºC扩增反应。检测方法是：a、免疫富集；b、热裂解上述产物、经磁力架分离，将含有病毒核酸的上清作为环介导等温扩增反应的模板；c、环介导等温扩增反应；d、结果判定。该试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，可广泛应用于各级疾病预防控制机构，流感监测网络实验室，哨点医院等对发热病人鼻咽拭子等标本的甲型H1N1流感病毒的检测和监测。

主权项

一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：A、免疫富集反应体系组分：标记甲型H1N1流感病毒特异性单克隆抗体的免疫磁珠，直径：100‑300 nm；工作稀释浓度：1:10‑1:20；0.1 M 磷酸盐缓冲液pH 7.2‑ pH 7.4；无菌超纯水；B、环介导的等温核酸扩增体系组分：Bst DNA聚合酶、10×Bst DNA聚合酶缓冲液、AMV反转录酶、Calcein 、 dNTP 、Betaine、MgSO4、10×引物混合物：F3: 2 µM；B3: 2 µM；FIP: 16 µM；BIP: 16 µM；Loop‑1: 8 µM；Loop‑2: 80 µM；C、抗体的制备：采用标准B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗甲型H1N1流感病毒的单克隆抗体，并用正辛酸‑饱和硫酸铵沉淀法对制备出的抗体进行纯化 ；D、免疫磁珠的制备：选用直径为100‑300 nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺和琥珀酰亚胺共价偶联的方式将甲型H1N1流感病毒单克隆抗体共价交联到超顺磁颗粒上，交联后的超顺磁颗粒用BSA封闭；E、设计甲型H1N1流感病毒的特异性引物，用于环介导的等温65ºC扩增反应，包括两条外引物F3、B3、两条内引物FIP、BIP以及两条环结合引物Loop1、Loop2，序列分别如下：F3：CCGGAGACAAAATAACAT；      B3: GTATATTCTGAAATGGGAG；      FIP: GATCGAGCATTTCCTTCCAAAGCATCTGGAAATCTAGTGG；      BIP: TCAGTACACCAGTCCACGATTGCTGTTTATAGCTCCCTTG；      Loop1: GCAATACAACTTGTCAAACACC；      Loop2: TGCGAATGCATATCTCGGT。