一种制备重组耐热β-葡萄糖醛酸酶的方法

摘要

一种制备重组极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的方法，其制法是：将耐热β-葡萄糖醛酸酶基因插入表达载体pHsh，转化大肠杆菌获得耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒；其次是对基因进行诱变，改变mRNA的二级结构，得到优化的耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒；然后将耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒或优化的耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒转化大肠杆菌，得到基因工程菌，并通过热激诱导，使β-葡萄糖醛酸酶得到超量表达；最后收集细胞，破壁，离心后得到粗酶液，进一步纯化后得到纯酶。本发明首次使用表达载体pHsh对耐热β-葡萄糖醛酸酶的基因进行高效表达，并首次将重组的耐热β-葡萄糖醛酸酶应用于甘草次酸的制备。

主权项

一种制备重组耐热β‑葡萄糖醛酸酶的方法，其特征在于，用表达载体pHsh表达优化的耐热β‑葡萄糖醛酸酶基因，得到重组耐热β‑葡萄糖醛酸酶；具体方法步骤如下：(1)将耐热β‑葡萄糖醛酸酶基因插入基因表达载体pHsh，构建成耐热β‑葡萄糖醛酸酶表达质粒；所说的耐热β‑葡萄糖醛酸酶基因，是海栖热袍菌的β‑葡萄糖醛酸酶基因；(2)对耐热β‑葡萄糖醛酸酶表达质粒中的mRNA翻译起始区潜在的二级结构进行在线分析，对海栖热袍菌的β‑葡萄糖醛酸酶的基因设计改变基因内部碱基的突变引物为，引物1：5’‑aggagatataaacatggtaagaccgcaacgaaa‑3’，引物2：5’‑tcttgtcaacaattaacaggtcattggatcatgg‑3’，以耐热β‑葡萄糖醛酸酶表达质粒为模板进行定点诱变，得到优化的耐热β‑葡萄糖醛酸酶表达质粒；(3)用优化的耐热β‑葡萄糖醛酸酶表达质粒转化大肠杆菌获得基因工程菌，并在基因工程菌的生长过程中进行热激诱导，使耐热β‑葡萄糖醛酸酶得到超量表达；(4)收集细胞，破壁并离心获得粗酶液；(5)对上述粗酶液中的重组酶进行纯化得到纯化的重组耐热β‑葡萄糖醛酸酶。